Février 2002 - n°65

CIPHERGEN Biosystems Inc.
The ProteinChip® compagny

Fondé aux USA en 1997, implanté sur l’Hexagone depuis près d’un an et fort de l’acquisition de la société française BioSepra, le groupe CIPHERGEN Biosystems enregistre une croissance rapide. Ses effectifs européens ont plus que doublé depuis janvier 2001.
Clé de cette réussite : un système particulièrement novateur qu’il développe, produit et commercialise dans le monde entier - le système ProteinChip® SELDI-TOF.
Un système dédiè à la séparation, la détection et l’analyse des protéines, et ce très rapidement, à partir de quelques microlitres d’échantillons biologiques bruts et avec un seuil de détection de l’ordre de la femtomole.
Véritable alternative aux méthodes traditionnelles telles que l’électrophorèse 2D, l’analyse d’ARNm ou les tests immunologiques, la technologie ProteinChip® se révèle particulièrement efficace pour la découverte de biomarqueurs cellulaires, l’étude d’interactions moléculaires spécifiques (anticorps/antigène, récepteur/ligand, protéine/ADN), mais aussi pour la purification et la caractérisation de protéines. Des études qui nécessitaient des jours, des semaines, voire des mois, peuvent désormais être réalisées en un après-midi !

Séparation – Analyse – Détection, sous une seule plate-forme technologique

Séparation – Détection - Analyse : ces trois étapes sont indissociables lors des études protéomiques et elles étaient jusque là réalisées sous trois plates-formes distinctes, souvent difficiles à mettre en œuvre et à optimiser. Plate-forme unique combinant la technologie des puces à protéines, la chromatographie d’affinité par retention, la spectrométrie de masse et les logiciels d’exploitation informatique, le système ProteinChip® de CIPHERGEN Biosystems révolutionne la protéomique.

“ Une précision, tout d’abord, sur les “ ProteinChip® ” ”, expose le Dr Isabelle BUCKLE, Directeur CIPHERGEN Biosystems France. “ La technologie des puces à protéines fait référence à deux formats de puces bien distincts. Le premier concerne les puces à haute densité (“ High density ” spotted arrays ), analogue des puces à ADN ; ses applications se limitent aux interactions protéine-protéine et impliquent une détection par colorimétrie ou fluorescence.
Le système CIPHERGEN repose quant à lui sur une technologie tout à fait différente, bien que portant aussi le nom de “ puces à protéines ”. Il s’agit de puces à basse densité personnalisable (“ low density ” customizable ProteinChip Arrays) ”, également appelées “ chips ” ”.
Eléments clés de la technologie ProteinChip®, elles se présentent sous la forme de barrettes sur lesquelles sont alignés 8 à 24 sites actifs (ou “ spots ”). Ces spots , d’un diamètre de 1 mm, peuvent être constitués de surfaces très variées, tant sur le plan chimique (surfaces anioniques ou cationiques, hydrophobes ou hydrophiles…) que biologique (anticorps, récepteurs ou ADN…), d’où leur capacité à retenir par affinité des protéines d’intérêt, qui pourront ensuite être éluées selectivement par des conditions de lavages plus ou moins stringentes et caractérisées par combinaison de la chromatographie d’affinité et de la spectrométrie de masse (SELDI – TOF MS). Ainsi un seul echantillon pourra générer plus de 96 spectres differents en quelques heures.
Notons que 8 barrettes de 8 spots constituent une plaque 96 puits, utilisable dans la technologie ProteinChip® via une interface Bioprocesseur. Au-delà, une plaque de 192 puits peut également être employée grâce à la robotisation du système.

Zoom sur la préparation de la puce ProteinChip®

Après une phase de préparation (mise au point de protocole, fractionnement des échantillons…), la technologie ProteinChip® repose sur trois étapes :
1- La première étape consiste à déposer sur chaque spot quelques µl d’un extrait brut (de 1 µl à 400 µl de sérum, d’urine, d’extraits tissulaires…). Grâce à des interactions par affinité, les protéines de l’échantillon se lient aux “ sites d’amarrage ” chimiques ou biologiques dont est dotée la surface de la puce ProteinChip®.
2- Seconde étape : le lavage de la ProteinChip®. Chaque spot est lavé pour éliminer les protéines retenues de manière non spécifique ainsi que toutes substances qui peuvent interférer (sels, détergents…). Le “ bruit ” de fond de l’échantillon est ainsi éliminé, quel que soit le tampon utilisé pour sa préparation.
3- Addition de l’EAM (Energy Absorbing Molecules). La puce est séchée et l’EAM est appliquée sur chaque spot pour faciliter la désorption et l’ionisation générée par laser dans le lecteur SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization) – TOF (temps de vol) - MS.
En quelques secondes, sont ainsi déterminés les masses moléculaires des différentes protéines capturées. Un logiciel spécialisé permet de comparer simultanément les profils d’expression de protéines obtenus sur les différents spots. Trois types de visualisation sont alors proposés : tracé MS, cartographie ou gel virtuel.

La protéomique clinique :

Au-delà de l’avancée technologique générée par le système ProteinChip®, c’est l’approche clinique elle-même qui est révolutionnée.
Dans un développement clinique “ classique ” tel que celui conduit par Gel 2D / MS pour la découverte et la validation de nouveaux biomarqueurs, la phase Découverte de molécules est immédiatement suivie par celle d’Identification. C’est là que commencent souvent les difficultés, avant même le Développement d’essai, puis la Validation finale.

“ Avec la technologie ProteinChip® SELDI-TOF, cette succession d’étapes est entièrement chamboulée ”, affirme Mme Isabelle BUCKLE, “ La phase Découverte permet de repérer les protéines dont l’expression varie d’une population à l’autre, grâce à l’analyse d’un nombre restreint d’échantillons. Une fois le marqueur d’intérêt découvert, le système SELDI offre l’opportunité de traiter un grand nombre d’échantillons (une centaine par semaine) dans des conditions de Validation. La phase d’Identification n’est alors réalisée qu’en fin d’étude ”
Premier atout évident : la réduction des temps et des coûts de développement clinique.
L’analyse différentielle des profils d’expression protéiques, obtenus à partir de différents liquides biologiques ou extraits tissulaires, s’est déjà montrée particulièrement performante dans la mise en évidence de protéines en tant que marqueurs dans le diagnostic des cancers de la prostate, de la vessie ou encore de l’ovaire.
Dans le cas du cancer de la prostate, par exemple, 3 jours ont suffi pour découvrir plusieurs marqueurs potentiels de la maladie. Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients au stade avancé du cancer et chez des patients témoins. Avec 1 µl de sérum de chaque patient déposé par “ spot ”, les chercheurs ont pu tester les différentes surfaces ProteinChip®. En utilisant une surface hydrophobe, 4 protéines dont l’expression était sur-exprimée et une protéine dont l’expression était réprimée au cours du cancer, ont été immédiatement mises en évidence.

La recherche protéomique

En recherche, également, la protéomique connaît déjà des résultats intéressants. Ainsi, la technologie ProteinChip® s’est-elle révélée très efficace pour l’étude des interactions moléculaires spécifiques dans des domaines aussi variés que les neurosciences, l’étude des maladies infectieuses ou encore le contrôle de transgènes dans les espèces végétales.
Citons, à titre d’exemple, l’utilisation du système CIPHERGEN, à l’hôpital St George de Londres, pour capturer “ on chip ” avec un anticorps, puis détecter quantitativement différents peptides b -amyloïdiques, marqueurs potentiels du diagnostic de la maladie d’Alzheimer. Plusieurs nanomoles de ces peptides ont été détectées à partir de quelques cellules seulement. Après ces travaux réalisés en une semaine, la mise au point d’un diagnostic pré-symptomatique de la maladie d’Alzheimer est étudié. “ L’avantage majeur de la technologie ProteinChip® réside ici dans la possibilité de mesurer quantitativement la présence d’un ensemble de peptides à l’aide d’un seul anticorps ”, souligne Mme BUCKLE.

Le process protéomique

Le développement de process en biopharmaceutique repose traditionnellement sur les compétences de plusieurs départements : R&D - Optimisation de procédés et Changement d’échelle - Production et Contrôle-qualité. Une organisation discontinue qui pose parfois quelques problèmes de communication entre les différentes équipes. Aussi, l’objectif de CIPHERGEN Biosystems est-il d’adapter sa technologie au changement d’échelle : de la R&D aux applications industrielles. C’est dans le but de renforcer son pôle Séparation et de créer une véritable continuité avec la production industrielle, que CIPHERGEN Biosystems a procédé en août 2001 à l’acquisition de la société BioSepra.
“ Spécialiste du process analytique, l’équipe BioSepra développe et commercialise des gels pour colonnes chromatographiques, en parallèle d’une activité de conseils et de services ”, précise Isabelle BUCKLE.
Désormais, grâce à la combinaison de son système ProteinChip® SELDI-TOF et des outils de séparation BioSepra, CIPHERGEN Biosystems est en mesure de proposer une approche protéomique globale : de la recherche à la clinique, jusqu’à la purification et l’analyse protéique à l’échelle industrielle.

SDenis

Contact :
CIPHERGEN Biosystems France
Mme Isabelle BUCKLE