Septembre 1996 - n°10
Technique analytique CE-LIF-ID (Capillary Electrophoresis Laser Induced Fluorescence Immuno Detection)
Introduction
Les Immuno-essais sont largement utilisés dans le cadre d'analyses
quantitatives en environnement biomédical et clinique. Leur principal
intérêt réside dans le fait qu'ils permettent de quantifier
des traces du composé cible, peptides ou protéines, au sein d'un
milieu très complexe et concentré ("matrice") tel que
le sérum.
Les immunoessais sont basés sur la réaction spécifique
entre un anticorps et l'antigène correspondant. En utilisant des révélations
basées sur la radioactivité (RIA), la fluorescence, ou une réaction
enzymatique (EIA), une détection de très haute sensibilité
peut être atteinte. Le système, le plus couramment utilisé,
est celui dans lequel l'anticorps ou l'antigène est immobilisé
sur un support tel que la paroi d'un puits de microplaque ou l'intérieur
d'un tube à essai.
Bien que donnant d'excellents résultats, les immunoessais phase solide
souffrent de quelques inconvénients liés à l'immobilisation
sur le support.
En effet, un temps non négligeable est accordé à la mise
au point des conditions d'immobilisation afin que celle-ci soit reproductible
et stable. En complément, les étapes de lavage ou de rinçage
doivent être, elles aussi, développées.
Si la technique EIA est choisie, il convient de développer la procédure
de conjugaison et la stabilité de l'enzyme, ainsi que celle des anticorps
et antigène.
Si la technique RIA est retenue, il faut tenir compte des coûts liés
à l'achat de produits radiomarqués ainsi que ceux liés
au traitement des déchets. Le protocole complet est long, I'étape
de révélation pouvant durer plusieurs heures, voire toute la nuit.
Considérant ces difficultés, les immunoessais en électrophorèse
capillaire peuvent présenter une alternative originale. En effet, les
formes liées et libres de l'antigène ou de I'anticorps marqué
peuvent être séparées sans utilisation de support solide.
En utilisant un composé marqué à la fluorescence et avec
une détection par Fluorescence Induite par Laser une limite de détection
de l'ordre 10-11 M peut être obtenue.
Description d'un protocole
type:
De façon à illustrer cette technique nous pouvons choisir
le cas d'une analyse d'immunoessais par compétition. La méthode
recourt à l'utilisation d'un antigène purifié (angiotensine
11 utilisé comme exemple) marqué avec le fluorophore cyanine stable
(Cy5*).
La réaction immunitaire angiotensine Il / anti-angiotensine 11 se déroule
en solution et la séparation, entre la forme libre et liée de
l'antigène, est réalisée grâce au pouvoir séparateur
de l'électrophorèse de zone (CZE) éliminant ainsi l'étape
de rinçage ainsi que celle d'immobilisation.
La détection est faite par Fluorescence Induite par Laser. Dans ces conditions,
les peptides et protéines non dérivés ne sont pas détectés.
Ainsi les lignes de base sont très propres et les électrophorégrammes
faciles à interpréter. Les expériences ont été
réalisées sur un système d'électrophorèse
capillaire, modèle P/ACE de Beckman équipé d'un détecteur
laser He/Ne 633 nm.
conclusion:
Les immunoessais par électrophorèse capillaire avec détection
induite par laser offre la possibilité de réaliser des dosages
rapides de protéines et peptides au sein de fluides biologiques, y compris
le sérum.
Par extension, des dosages simultanés de plusieurs couples anticorps-
antigènes sont même envisagés.
Au vu des premiers résultats obtenus et par ses perspectives, ce type
de méthode semble être un outil analytique tout à fait prometteur
pour la biorecherche, le diagnostic et l'industrie pharmaceutique.
Rétérence
Mr R. GROULT
Mr R. BOCQUENTIN
BECKMAN INSTRUMENTS