Octobre 1996 - n°11
Protocoles de nettoyage et de régénération des colonnes HPLC
Afin de conserver une efficacité maximale de vos colonnes HPLC il est important de suivre quelques précautions de base:
Les solvants sont responsables de 60% de la dégradation
de la colonne
- utilisez toujours des solvants de qualité HPLC
- utilisez une eau ultraqure (spécialement pour les gradients)
- filtrez vos solvants sur membrane 0.45µ (veillez à la compatibilité
des membranes avec les solvants employés)
- dégazez régulièrement vos solvants (à l'hélium,
sonication ou aspiration sous vide)
- préparez de nouveaux solvants extemporanément
- lors de mélanges, contrôlez la miscibilité de vos solvants
- ne dépassez jamais les limites de pH de vos colonnes (de façon
générale pH 3-7 pour les colonnes à base silice et pH 2-
11 pour les colonnes polymériques)
- appliquez toujours un débit progressif à votre colonne
L'échantillon peut également contribuer à la détérioration de la colonne:
- filtrez si possible sur filtre 0.45 µm
- si l'échantillon est trop complexe, faites une préparation sur
cartouche d'extraction en phase solide (SPE)
- n'injectez pas d'échantillon trop concentré
- préparez votre échantillon dans la phase mobile d'analyse (phase
initiale pour les gradients) afin de vous assurer d'une totale solubilité
- en cas de gradient, vérifiez toujours la miscibilité de votre
échantillon avec la composition finale de la phase éluante
- utilisez une pré-colonne ou un préfiltre si nécessaire
en amont de la colonne.
La colonne:
- évitez les chocs physiques et thermiques (surtout
pour les phases polymériques)
- ne conservez par vos colonnes sous tampons ou sous eau pure plus de 48 heures,
sans les utiliser
- pensez à stocker vos colonnes selon les spécifications du fabricant.
Si l'efficacité de votre colonne diminue, il est possible de revitaliser la colonne dans sa pré-colonne .
Ces protocoles ne peuvent pas empêcher le vieillissement normal de votre colonne, il est important de contrôler la pression de travail avant et après ces protocoles ainsi que la résolution chromatographique. Si une baisse de 10% de la pression de travail ou une amélioration de 10% de la résolution ne sont pas observées, il est alors nécessaire de changer de colonne.
Volumes de colonne:
| 3.9 x 150mm 3.9 x 300mm 4.6 x 150 mm 4.6 x 250 mm 4.0 x 125 mm |
1.8ml 3.6ml 2.5 ml 3.6 ml 1.6 ml |
3.9 x 75mm 3.9 x 100mm 4.6 x 50 mm 4.6 x 100 mm 4.0 x 250 mm |
O.9ml 1.2ml 0.8 ml 1.6 ml 3.1 ml |
Colonne Phase Inverse (C18,
C8, CN )
Contamination non-protéique: Faire passer à
1 ml/min 10 volumes de colonne des solvants suivants: eau, méthanol,
chloroforme, méthanol, eau ou remplir votre colonne avec 10% d'isopropanol
et laisser durant toute une nuit puis rincer avec de l'eau.
Contamination protéique:
Injecter 200 ,ul de 50/50 DMSO/eau, toutes
les 5 minutes durant 10 volumes de colonne en eau; puis rincer la colonne avec
chacun des solvants selon l'ordre suivant: méthanol, chloroforme, méthanol,
eau.
Contamination par les métaux:
Rincer pour 10 volumes de colonne avec de l'acide oxalique 0.01M
ajusté à pH 3.5
avec NaOH.
Colonne en phase normale (silice)
Rincer avec 50 ml d'isooctane, 50 ml de chlorure de méthylène,
50 ml de méthanol, 50 ml de chlorure de méthylène et 50
ml d'isooctane (les solvants indiqués ne doivent pas contenir plus de
500 ppm d'eau).
Colonne échangeuse d'ions
à base silice (SCX ou SAX)
Rincer avec 10 volumes de colonne de chacun des solvants suivants: H3P04, 0.05M,
eau, 0.1 M Disodium EDTA, eau, méthanol et eau.
Colonne échangeuse d'ions
à base polymérique (méthacrylate -SP, CM, QMA ou DEAE)
Rincer avec 4 volumes de colonne de chacun des solvants suivants: Eau -0,1M
NaOH - Eau - 30% acide acétique - Eau -1.0M Nacl - Eau.
Si pas d'amélioration, incuber la colonne avec 1 mg/ml d'un enzyme protéolytique
(Pepsine, Trypsine...) durant une nuit puis reprendre le protocole précédent.
Contamination lipidique:
Rincer pour 4 volumes de colonne avec 50/50 Ethanol/eau puis par 100% d'eau
(ne pas utiliser d'alcool à chaine longue).
Polymérique (Styrène-DVB
SP, CM, QMA, ou DEAE)
Retourner la colonne, rincer avec 0.2M de NaOH à 90°C et à
0.5 ml/min pendant 2 heures, puis retourner la colonne, réguler en température
et rcoquilibrer sous solvant initial.
Alex TISSERAND
PHASE SEPARATIONS - Division de Waters SA