LA SYNTHESE PEPTIDIQUE EN PHASE SOLIDE

L'engouement relatif aux peptides est né dès la fin des années 60, quand est apparu la possibilité de synthétiser chimiquement à façon de grandes quantités de peptides.
En effet, I'identification de peptides à activité biologique est à la base du développement de nombreuses thérapies: de nombreux peptides naturels ont été caractérisés et portent des activités biologiques très diverses. Citons par exemple: les hormones, les inhibiteurs d'enzymes, les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs, les immunomodulateurs...
Le peptide de synthèse est promis à un bel avenir: c'est un outil de choix pour des applications aussi diverses que nombreuses dans les domaines de la biologie moléculaire, de la biochimie, de la médecine, du diagnostic et du développement de vaccins et de nouveaux médicaments. Ie peptide est, soit utilisé directement pour ses propriétés pharmacologiques, soit pour permettre d'approfondir la compréhension des mécanismes biologiques dans lesquels il intervient.
De façon très schématique, les principales applications développées avec les peptides synthétiques ont pour objectif d'imiter les caractéristiques de portions d'une protéine beaucoup plus longue. Des petits fragments sélectionnés de la protéine sont synthétisés et testés dans des essais blologiques. Cette approche vise à déterminer les sites actifs des protéines: les sites récepteurs, les sites effecteurs et activateurs, les sites de fixation. Les divers sites fonctionnels d'une protéine sont ainsi accessibles. Cependant, alors que l'intérêt du peptide a été validé en recherche, les applications cliniques restent encore limitées. Une raison essentielle est leur rapide dégradation in vivo par les peptidases. A contrario, le peptide présente l'énorme avantage de ne pas générer de métabolite toxique.
Différentes méthodologies sont utilisées pour le développement de "peptides médicaments". Grâce à la modélisation moléculaire, les acides aminés peuvent être remplacés par des résidus "exotiques", les liaisons chimiques entre résidus peuvent être remplacées par des liaisons résistantes, ce qui permet de conserver les propriétés caractéristiques intrinsèques du peptide tout en augmentant son temps de demi-vie et/ou son affinité pour sa cible. De tels peptides pharmacomodulés seront la voie de développement de médicaments très sélectifs, basés sur les peptides déjà sélectionnés par la Nature.
Le développement de vaccins ou de tests diagnostics est un domaine où un très grand nombre de peptides sont utilisés. Dans les deux cas, la séquence entière de la protéine est synthétisée sur un support de cellulose sous la forme de peptides courts se chevauchant. Les peptides sont ensuite analysés pour leur reconnaissance par le ou les anticorps antiprotéine du sérum humain ou du sérum de mammifère (cartographie des épitopes, régions immunogènes de la protéine). Les peptides qui réagissent peuvent être identifiés et optimisés afin d'être utilisés en routine pour le diagnostic ou encore comme vaccins synthétique pour induire des anticorps.

Une telle méthode est aussi applicable à la détermination des zones reconnues par les anticorps auto-immuns.La synthèse de peptides courts chevauchants libres permet, quand à elle, de faire la cartographie des épitopes T impliqués dans l'immunité à médiation cellulaire.
La pharmacologie est une autre grande consommatrice de peptides: un grand nombre de peptides sont synthétisés et testés pour leur interaction avec un récepteur ou leur capacité à induire une réponse biologique.
Les séquences sélectionnées sont alors synthétisées avec diverses modifications guidées par la modélisation moléculaire qui permettent de déterminer les pharmacophores (les structures importantes pour l'activité pharmacologique). Une stratégie prometteuse pour l'identification des pharmacophores est la synthèse de banques combinatoires de peptides ou de peptidoïdes couvrant un domaine structural assez large. Ici encore, la modélisation moléculaire permet de restreindre et de rationaliser l'espace conformationnel à explorer. Un test de criblage biologique est alors appliqué afin de déterminer les molécules d'intérêt.

La synthèse peptidique constitue un défi que les chimistes organiciens s'efforcent de relever depuis le début du siècle. Synthétiser un peptide reste un "art".
Les peptides sont de petits fragments de protéines d'une taille comprise entre 2 et quelques dizaines d'acides aminés. Les résidus d'acides aminés d'une chame peptidique sont reliés entre eux par la liaison peptidique, une liaison amide (-CONH-). Ces liaisons sont formées de façon artificielle au cours de la synthèse chimique des peptides.
Les difficultés inhérentes à la synthèse peptidique proviennent de la structure même de leurs constituants de base, les acides aminés, qui portent des substituants aux propriétés physico-chimiques très diverses.
Un acide aminé porte 4 substituants situés aux sommets d'un tétraèdre autour du carbone central.

Il existe 20 acides aminés naturels qui se différencient par leur chame latérale R: dimension, forme, charge, capacité à former des liaisons hydrogène, hydrophobicité, et bien sûr réactivité chimique. La nature chimique de R est soit aliphatique (aucune fonction réactive) soit Alcool, Sylphydrile, Amine (primaire, imidazole ou guanidinium), groupement cyclique secondaire, acide ou carboxamide, aromatique, indole.
Pour former la liaison peptidique entre 2 acides aminés successifs (M1 et M2 dans le schéma qui suit) dans la séquence désirée, avec le départ d'eau, il faut utiliser un agent de déshydratation.

La réalité est pourtant bien différente. Dans une telle réaction le dipeptide AA1-AA2 serait ultraminoritaire dans le mélange réactionnel, pour plusieurs raisons:

Si l'on ne bloque pas la fonction H2N (amine a) de AA1 et la fonction COOH de AA2, on forme aussi bien AA1-AA2 que AA2-AA1 et encore AA1-AA1, AA2-AA2, ainsi que des polymères plus lourds, la réaction n'ayant aucune raison de s'arrêter parés le premier couplage.
Si i'on ne bloque pas les fonctions réactives éventuellement portées par R1 et R2, il se formera aussi des branchements latéraux de diverses manières.

Il est donc nécessaire d'utiliser des groupements protecteurs si l'on veut obtenir un seul produit. Une contingence supplémentaire apparaît aussi: I'othogonalité des protections. En effet, lorsque l'on voudra coupler un 3ème acide aminé AA3, il faudra pouvoir libérer sélectivement la fonction COOH de AA2 pour permettre la formation de la liaison nouvelle peptidique.
Notons que la synthèse chimique des peptides à lieu dans le sens contr`aire de la synthèse biologique, la raison est fort simple: la nature sait activer la fonction amine (NH2) lors de la formation des aminoacyltRNA, le chimiste ne sait qu'activer la fonction carboxyle (COOH) par formation d'un anhydride symétrique ou d'un esten
Avant de pouvoir synthétiser un peptide, les problèmes à résoudre par les organiciens ont donc été les suivants:

Disposer d'une stratégie d'activation de la fonction -COOH de l'acide aminé à introduire dans le peptide, qui permette des rendements de couplage supérieurs à 99.99%. En effet, le rendement en produit final décroît exponentiellement avec le nombre d'étapes de couplage: si le rendement n'est "que" de 90% à chaque couplage, (ce qui est déjà excellent pour une réaction organique) au 15ème AA, le rendement final sera (0.9^15) soit 20%.
Disposer de groupements protecteurs des fonctions latérales -OH, -SH, -COOH, -NH2, -HN-(C=N)-NH2, -NH-, et savoir les enlever spécifiquement avec une efficacité proche de 100% à la fin de la synthèse du peptide.
Disposer de groupements protecteurs de la fonction -NH2 à engager dans la prochaine liaison peptidique, et savoir les enlever spécifiquement entre chaque étape de couplage, là aussi avec un rendement quantitatif, sans toucher aux protections latérales.

Ce n'est pas tout: pour arriver au produit final, il faut être capable à chaque étape de couplage de débarrasser le peptide en croissance des réactifs mis en excès, des groupements protecteurs d'amine clivés, et autres produits indésirables. Deux approches sont utilisables: synthèse en phase liquide, avec purification du peptide entre chaque étape, et synthèse sur support solide (résine polymère) où la séparation se fait par simple rinçage parés les étapes de couplage et de clivage de la protection intermédiaire.

Chacune de ces méthodes a ses avantages et inconvénients. La synthèse en phase liquide est longue et fastidieuse (au minimum, deux AA par jour) mais elle peut travailler sur des quantités très importantes, de plus la purification intermédiaire garantit du produit final très propre. La synthèse sur support solide est beaucoup plus rapide, elle est automatisable entièrement, mais reste limitée en quantité à quelques grammes de peptide par synthèse. Elle est plus exigeante au point de vue des rendements de couplage et déprotection intermédiares, car i'on conserve sur la résine toutes les ratées de couplage. Il faut donc des rendements excellents. Il faut aussi disposer d'un support adéquat pour l'élongation du peptide, et être capable de cliver le peptide de la résine en fin de synthèse.
La suite de notre propos sera consacrée à la mise en œuvre de la synthèse en phase solide:
réactifs et instrumentation.

Dans une série d'articles de 1962 à 1964, R.B. MERRYFIELD à posé les bases de cette stratégie, qui s'est depuis très largement imposée. Le principe général est depuis resté le même, mais des améliorations techniques à tous les niveaux l'ont rendue très praticable.

Le schéma montre le principe itératif de la méthode: Le cycle d'addition commence par la déprotection de la fonction amine du peptide en croissance, puis l'addition de l'AA suivant activé, ce qui donne un peptide protégé augmenté d'un M, prêt pour un nouveau cycle. La force de la synthèse sur support solide réside dans les lavages: en phase liquide il faut traduire lavage par purification, Iyophilisation, caractérisation et re-solubilisation. Lorsque le peptide complet est assemblé, le dernier AA est déprotégé, puis les protections latérales sont enlevées et le peptide est clivé du support (ces deux dernières opérations peuvent se faire de façon concomitante). Le peptide libre est purifié, puis caractérisé.

Nous allons passer maintenant en revue les divers points clés de la synthèse sur support solide d'un point de vue pratique: quelles sont les options les plus courantes actuellement, les contrôles de qualité et l'instrumentation, puis nous parlerons de développements de synthèse multiple et de synthèse combinatoire.

groupements protecteurs de la fonction amine a :
Deux stratégies de protection sont en concurrence: stratégie Boc et stratégie Fmoc.
La stratégie Boc, la plus ancienne utilise un groupement tertiobutyloxycarbonyle pour protéger la fonction a amine de l'AA à coupler. Boc est labile en milieu acide, chaque déprotection intermédiaire a lieu dans un milieu assez agressif, I'acide trifluoroacétique (TFA). La déprotection crée un carbocation très réactif susceptible de donner des réactions secondaires. Les protections latérales doivent résister au TFA; et sont clivées en conditions hyperacide par l'acide fluorhydrique (HF) d'un maniement assez dangereux. La stratégie Fmoc utilise le fluorenemethoxycarbonyle, labile en miiieu nucléophile, il est clivé en quelques secondes par une solution de pipéri dine dans le DMF (diméthyformamide) dans des conditions douces. Les protections latérales doivent être stables en milieu basique et clivées en condition acide (TFA). Les Fmoc-AA sont plus coûteux que les Boc AA, mais l'ensemble des opérations de clivage sont plus douces pour le peptide et l'utilisateur. Cette stratégie est employée en routine dans notre laboratoire de production et nous donne entière satisfaction. Elle est bien adaptée aux synthétiseurs automatiques, la déprotection peut être suivie en spectrophotométrie U.V. ce qui permet de mesurer l'efficacité des couplages.

L'activation des acides aminés
L'activation classique d'un acide aminé consiste à replacer l'H du COOH par un groupement bon partant. De nombreuses solutions ont été proposées. Les solutions courantes sont l'utilisation d'esters actifs, ou l'utilisation d'anhydrides symétriques. La réaction doit être rapide et totale, aussi travaille-t-on avec des concentrations aussi élevées que le permettent les solubilités et de larges excès molaires d'AA activés (3 à 10) de façon à accélérer les vitesses de couplages et pousser les réactions jusqu'au bout. Le lavage de la résine permet d'éliminer facilement excès d'AA n'ayant pas réagi. Les stratégies d'activation sont les mêmes que l'on travaille en Boc ou en Fmoc.

Anhydrides symétriques:
On utilise un carbodilmide, le DIPCDI, agent déshydratant qui permet de former l'anhydride symétrique in-situ.

Celui-ci est ensuite attaqué par l'amine du peptide en élongation pour former la liaison amide et libérer un acide libre

Le couplage est rapide et efficace, mais cette méthode est coûteuse, car le seul des deux AA de l'anhydride sera utilisé. Si l'on travaille avec un excès molaire de 5, on utilise seulement le dixième de la quantité d'AA mise en jeu.

Esters actifs:
Ici le groupement partant est un alcool. La réaction doit avoir lieu en présence d'une amine tertiaire forte pour capturer l'alcool (un phénol acide) formé.
R'-NH2 + R-COOR" + DIEA -> R-CONH-R' O- DIEAH+
Les esters de pentafluorophénol (Fmoc-AA- oPfp) sont commerciaux, ou peuvent être préparés par couplage par un carbodilmide, puis isolés par cristallisation. Ils donnent des couplages très rapides. Leur prix est très élevé. Les esters de DHBT sont aussi des réactifs très performants. Les esters actifs de DHBT sont aussi des réactifs très performants.
Les esters actifs de HOBT (hydroxybenrotriazole) peuvent être formés in-situ, soit en passant par l'anhydride symétrique, soit en utilisant un réactif "moderne" tel que le réactif de Castro (Bop et évolutions PyBop) ou le réactif de Knorr (TBtu et évolutions HAtu). La présence de HOBT semble diminuer des réactions secondaires de racémisations. Des agents de couplage aux noms exotiques apparaissent régulièrement dans les catalogues. Nous avons utilisé en interne la plupart des réactifs cités sur de grands nombres de peptides sans trouver de réactif "miracle" et notre choix a été orienté par le coût, la simplicité, et l'innocuité, plus que par des avantages d'efficacité. Chaque laboratoire a ses préférences pour les stratégies d'activation et l'on peut dire que l'activation n'est pas le principal problème en synthèse peptidique.

Le support de synthèse
Elément crucial, le support de synthèse est un polymère synthétique qui doit présenter une bonne solvatation dans les solvants organiques employés au cours du cycle d'élongation (DMF, pipéridine/DMF), sans être solubilisée. La résine doit gonfler et être bien perméable pour exposer tous les sites aux réactifs de synthèse. Les supports polystyrène (PS) utilisés jusque dans les années 80 (résines de Merrifield) se tassent dans les solvants polaires (DMF et enfouissent le peptide, et à l'inverse gonflent dans les solvants apolaires, condition où le peptide polaire se replie en pelote et réagit difficilement. Le tassement bouche les colonnes de synthèse et fait apparaître de fortes pressions dans les appareils à flux continu. Plusieurs évolutions ont grandement amélioré la situation: Enrobage de gains de silice comme support mécanique (résines K), greffage de bras porteurs polaires comme le polyéthylène glycol (résines PEG-PS) ou changement de polymère pour des polymères--de type polyacryliques et copolimères polyacryliques /ß Alanine (résines Expansine), polyacrylamide/polystyrène, polyacrylamide/polyéthylène glycol. Nous utilisons en routine des résines de type PEG-PS, K et Expansine pour les synthèses en flux continu et des résines Expansine, PS et PEG-PS pour les synthèses en "batch".

Le maillon
Le clivage du maillon permet de récupérer le peptide libre en fin de synthèse. En stratégie Fmoc, le maillon est clivé par le TFA, en même temps que les chaînes latérales. Selon la nature de la liaison du premier acide aminé au maillon on obtiendra soit un peptide au COOH libre (liaison ester) soit un peptide-amide (liaison amide). La mise au point d'un bon maillon est délicate, à cause de nombreuses réactions secondaires.(racémisation, cyclisations, alkylations). Selon la nature de l'acide aminé C terminal, le peptidiste est amerié à utiliser des maillons différents pour éviter ces problèmes. Citons enfin l'existence de maillons hyperlabiles qui permettent de récupérer les peptides sans déprotection des chaînes latérales. Ces peptides protégés pourront être couplés entre eux, ce qui permet d'accéder à des peptides de tailles très importantes. Les catalogues des fournisseurs spécialisés dans la synthèse peptidique offrent un grand choix de résines dérivées par des maillons et des acides aminés protégés adaptés aux diverses stratégies de synthèse et clivage. Parmi les maillons les plus employés ,en synthèse Fmoc, citons le maillon MBHA-Rink- amide, les maillons HMBA, HMPA, HMPB.

Protections latérales:
Les protections standard des chaînes latérales en synthèse Fmoc sont stables en milieu basique et clivables par l'acide trifluoroacétique. Les protections standard en synthèse Boc doivent résister au TFA 50% et sont clivées par HF liquide ou TFMSA, sauf Acm, clivé par l'iode/méthanol et Tos, clivé par HOBT 1 M. Le tableau suivant liste les protections utilisées classiquement. On est amené à utiliser des schémas de protections différents, qui permettent des déprotections sélectives, par exemple pour la formation de ponts dissulfure ou la phosphorylation.

Déprotection-clivage
Cette opération est possible en une seule étape en chimie Fmoc: Le maillon employé entre la résine et le peptide est lui aussi labile dans le TFÀ. En chimie Boc, plusieurs étapes sont nécessaires. Lors du clivage, les groupements protecteurs enlevés forment des carbocations très réactifs qu'il faut piéger par l'adjonction de scavengers (phénol, thiols, silanes, eau) afin des les empêcher de se fixer sur des sites sensibles du peptide. C'est notamment le cas avec le Pmc et le Pbf qui ont tendance à attaquer le tryptophane, s'il n'est pas protégé, et le tBu qui peut alkyler la tyrosine. Les thiols sont employés pour empêcher l'oxydation de la méthionine.
Après avoir incubé le peptide-résine dans la mixture de déprotection, la résine est enlevée par filtration, le "jus" de protection contient le peptide,les scavengers, l'agent de clivage, les protections piégées. Il faut alors procéder à la séparation du peptide, soit par précipitation à l'éther et lavages, soit par extractions liquide/liquide puis Iyophilisation. On obtient ainsi le peptide brut.

A suivre...
Nous avons fait un rapide tour d'horizon sur les principes de la synthèse peptidique en phase solide: stratégies, supports, réactifs de synthèse. Nous avons décrit brièvement diverses étapes menant à l'obtention du peptide brut. Selon l'usage envisagé, le brut peut être directement employé, ou devra être purifié par chromatographie. Nous développerons ces points dans une deuxième partie. Nous aborderons en particulier les contrôles analytiques de qualité des peptides.
Nous décrirons ensuite l'instrumentation de synthèse adaptée aux divers développements particuliers: synthèse en flux continu, en batch, synthèse multiple, synthèse combinatoire, synthèse spot.

Philippe CLAIR, Responsable du Laboratoire
Caroline ROUSSEL, Directeur du Marketing
synt:em