Février 1997 - n°15
Méthode officielle d'évaluation du potentiel irritant par application sur la membrane chorio-allantoïdienne de l'œuf de poule
Objectif et principe
Cette méthode est une alternative à l'expérimentation animale pour l'évaluation du potentiel irritant des produits cosmétiques.
Le principe en est basé sur l'observation, par une personne entraînée, des effets irritants (hyperémie, hémorragie, coagulation) pouvant survenir dans les cinq minutes suivant le dépôt d'un produit sur la membrane chorio-allantoïdienne (MCA) d'œuf de poule embryonné, au dixième jour d'incubation.
Dans le cas des produits cosmétiques, notamment à base de tensioactifs, cette méthode est applicable à l'évaluation du potentiel irritant oculaire.
Matériel (liste indicative)
Œufs de poule embryonnés (la souche White Leghorn est recommandée) d'un poids compris entre 50 et 65 g le jour de la réception.
Enceinte thermostatée
Incubateur à œufs
Lampe à mirer les œufs
Pince anatomique droite (pince à disséquer, brucelles...) à bouts mousse et sans mors
Ciseaux à bouts ronds
Bain thermostaté à 37°C
Chronomètre
Pipettes, tubes à essai, béchers...
Seringues de 1 ml à 5 ml
Balance de précision
Soluté injectable de pentobarbital
Eau pour préparations injectables
Soluté isotonique de NaCl à 0,9 p. 100
Protocole expérimental
Réception des œufs
Dès réception, les œufs fêlés ou cassés sont éliminés. Les autres sont conservés à l'abri de la lumière et à une température de 12°C ±1°C (enceinte ou local adapté) pendant au moins vingt-quatre heures avant de les placer en couveuse.
Mise en couveuse
Les œufs sont pesés et identifiés puis placés dans l'incubateur (température optimale : 37,8°C, humidité comprise entre 50et 60p. 100). Si l'incubateur n'est pas équipé d'un système de retournement automatique, les œufs doivent être retournés manuellement au moins deux fois par jour.
Pendant toute la durée de l'incubation, la température et l'humidité sont contrôlées et réglées si nécessaire.
Les œufs sont placés en position verticale (poche d'air vers le haut) dès le début dans le cas d'incubateurs équipés de plateaux oscillants et au huitième jour d'incubation dans les autres cas.
Vérification des œufs
Aux dixième jour d'incubation, les œufs sont mirés et les œufs défectueux sont rejetés.
Essai proprement dit
Les différentes étapes de l'essai sont enchaînées rapidement sous un éclairage d'une intensité suffisante ne dégageant pas de chaleur afin de ne pas dessécher la MCA. Dans le cas contraire, l'atmosphère est humidifiée à l'aide, par exemple, d'un brumisateur.
L'œuf étant placé verticalement sur un support (poche d'air vers le haut), la coquille est entaillée au niveau de la poche d'air en prenant soin de ne pas léser la MCA. A l'aide d'une pince ou d'une paire de ciseaux à bouts ronds, la coquille est enlevée jusqu'au niveau de la membrane coquillière. Toute la surface de la membrane coquillière est alors humidifiée avec du soluté isotonique de chlorure de sodium tiédi à 37°C. Le soluté est ensuite éliminé par inclinaison de l'œuf. Avec une pince la membrane coquillière est décollée délicatement puis retirée afin de découvrir la membrane chorio- allantoïdienne puis retirée afin de découvrir la membrane chorio-allantoïdienne sous-jacente.
Tout œuf dont la membrane chorio-allantoïdienne est défectueuse ou présente des traces d'hémorragie est rejeté.
0,30 ml du produit à l'essai (pur ou dilué), maintenu à 37°C, sont alors déposés délicatement sur la MCA à l'aide d'une seringue ou d'une pipette et le chronomètre est aussitôt déclenché. Après 20secondes de contact, la membrane est rincée avec 5ml de soluté isotonique de chlorure de sodium (maintenu à 37°C) à l'aide d'une seringue en évitant toute projection brutale. Le liquide de rinçage est éliminé par inclinaison de l'œuf. Les éventuels phénomènes d'irritation sont observés pendant 5minutes selon la procédure décrite ci-après. Le temps exact d'apparition de chaque phénomène est relevé.
L'effet irritant du produit à l'essai (ou de chacune de ses dilutions) est évalué sur quatre œufs. En fin d'essai, les œufs reçoivent une injection de pentobarbital puis sont éliminés.
Procédure de lecture
Les observations prises en compte pour la notation du produit doivent être réalisées à l'œil nu.
Les phénomènes observés (hyperémie, hémorragie, coagulation) ne sont pas retenus en fonction de leur intensité mais en fonction de leur présence: il s'agit d'une réponse de type tout ou rien.
Le temps est noté à l'apparition de chacun des phénomènes.
Hyperémie
Phénomène observé: des capillaires non visibles avant l'ajout du produit deviennent visibles, alors que les capillaires visibles se dilatent et deviennent plus rouges. Ce phénomène peut également affecter les vaisseaux de diamètre supérieur.
Hémorragie
Phénomène observé: libération de sang s'échappant des vaisseaux et/ou des capillaires, pouvant se présenter sous différents aspects, et notamment en "chou-fleur", en nappe, en voile diffus, en piqueté (le sang s'échappe ponctuellement à différents endroits de la membrane).
Il est à noter que :
- l'hémorragie peut présenter un caractère éphémère ; elle doit néanmoins être prise en compte ;
- l'observation, dans les 30premières secondes, d'une hémorragie massive impose la prise en compte de l'hyperémie masquée.
Coagulation (opacité et/ou thrombose)
Opacité :
Phénomène observé : apparition sur tout ou partie de la membrane, soit d'un voile opalescent évoluant éventuellement vers une opacification, soit d'une opacification directe.
Il est nécessaire de vérifier que le phénomène n'est pas lié au comportement physicochimique du produit en milieu aqueux (par exemple formation d'un colloïde, d'un précipité,...).
Thrombose :
G = gros vaisseaux
M = vaisseaux moyens
C = capillaires
Phénomène observé : rupture du flux sanguin dans les vaisseaux se traduisant par un aspect segmenté (alternance d'étranglements et de zones turgescentes plus ou moins sombres).
Il est à noter que les observations ne doivent pas prendre en compte les modifications intervenues au niveau des capillaires.
Résultats
Les phénomènes observés sont quantifiés selon le tableau ci-après, en fonction de leur délai d'apparition:
Le score pour chaque œuf est la somme des notes d'hyperémie, d'hémorragie et de coagulation. La notation du produit testé est la moyenne arithmétique, arrondie à une décimale des scores obtenus sur quatre œufs. La notation maximum est 21.
Le potentiel irritant sur la membrane chorio-allantoïdienne du produit à l'essai (pur ou dilué) est donné par l'échelle suivante:
Remarques importantes
Il est à noter que la reproductibilité des résultats est d'autant meilleure que la personne réalisant l'essai est entraînée et que les conditions expérimentales sont respectées.
De manière à vérifier la qualité des conditions opératoires et celle des expérimentateurs, il est conseillé de procéder régulièrement à des contrôles à l'aide d'une référence. A cet effet, l'établissement préalable d'une courbe étalon avec des solutions aqueuses à 0,05 p. 100 - 0,4 p. 100 et 3,2 p. 100(m/v) de lauryl sulfobétaïne est recommandé.
L'expérimentateur appréciera le potentiel irritant du produit à l'essai par comparaison aux données acquises pour des produits de même catégorie.
Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonne pratique de laboratoire.
Arrêté du 29 novembre 1996 relatif aux méthodes officielles d'analyse nécessaires aux contrôles des produits cosmétiques / Extrait J.O. du 26 décembre 1996.
Le ministre délégué aux finances et au commerce extérieur,
Vu le code de la consommation ;
Vu le décret du 22 janvier 1919 modifié portant règlement d'administration publique pour l'application de la loi du 1er août 1905 sur la répression des fraudes, et notamment ses articles 3 et 20 ;
Vu l'arrêté du 5 avril 1971 relatif aux méthodes officielles d'analyse de cosmétiques et produits de beauté, modifié en dernier lieu par l'arrêté du 11 mai 1993 ;
Vu l'avis de la commission générale d'unification des méthodes d'analyse,
Arrête :
Art. 1er. - L'arrêté du 5 avril 1971 susvisé relatif aux méthodes officielles d'analyse de cosmétiques et produits de beauté est complété par une annexe IV intitulée "Méthode officielle d'évaluation du potentiel irritant par application sur la membrane chorio-allantoïdienne de l'œuf de poule" qui figure en annexe du présent arrêté.
Art. 2. - Le directeur général de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes est chargé de l'exécution du présent arrêté, qui sera publié au Journal officiel de la République française.