Mai 1997 - n°18
L'introduction de la PCR en Biologie Moléculaire a permis d'amplifier des séquences spécifiques et d'atteindre des seuils de sensibilité très bas. Basée sur un principe simple, la PCR peut s'avérer difficile à optimiser. Un certain nombre de facteurs critiques ont été décrits dans la littérature. Cependant, il existe un certain nombre de "tuyaux techniques" faciles à mettre en œuvre, qu'il est bon de connaître, voire même d'afficher dans son laboratoire.
1/ Pour convertir des pmoles de primer en nanogrammes de primer:
(a x pmoles) (0,325 ng/pmole) x (b x bases)
a étant le nombre de pmoles de primer et b le nombre de bases du primer
Par exemple : pour calculer le nombre de nanogrammes correspondant à 50pmoles d'un 22mer:
(50 x 0,325ng) x (22) = 357,5ng
La concentration micromolaire (µM) d'un primer est équivalente à des pmoles/µl
Par exemple : 10 pmoles de primer dans une réaction PCR de 50µl correspondent à une concentration de 10pmoles/50µl= 0,2µM
2/ Pour optimiser le rendement en produits PCR, l'essai d'une incubation finale à 72°C pendant 5minutes, immédiatement après les cycles devrait réduire la légère traînée souvent observée sur le gel, sous le produit PCR désiré.
3/ Pour estimer les températures de fusion (Tm) des oligonucléotides:
Tm = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(%G+C) - (675/n)
n étant le nombre de bases de l'oligonucléotide
[Na+] étant la concentration saline molaire
Par exemple : Pour calculer le Tm d'un oligonucléotide 22mer avec 60% de G+C dans une solution de KCI0,05M
Tm = 81,5 + 16,6(-1,30) + 24,60 - 30,68 = 53,84°C
4/ Importance du magnésium
Pour des enzymes comme la Taq polymerase qui nécessite du Mg2+ comme cofacteur, il est important de contrôler avec précision les quantités de MgCI2. La concentration optimale se situe entre 1,0et 3,0mM. Il est recommandé de titrer la concentration en magnésium de 1,0à 3,0mM pour déterminer les meilleures conditions réactionnelles pour chaque type de réaction PCR.
Avec le temps, les solutions de MgCI2 peuvent former des gradients de concentration. Il est important de les homogénéiser parfaitement (vortex pendant plusieurs secondes) avant de les aliquoter dans les tubes de réaction PCR.
En effet, un excès de MgCI2 provoquera des hybridations non spécifiques du primer avec synthèse de bandes aspécifiques visibles sur le gel.
Un manque de MgCI2 induira une diminution de l'activité de l'enzyme thermostable.
Figure 1: Effets de la concentration de magnésium sur l'amplification PCR.
Les réactions PCR ont été réalisées avec des concentrations variables de Mg2+ pour montrer son effet sur l'amplification du gène de la luciférase (1,8kb). Les produits de la réaction ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose suivie d'une coloration au bromure d'éthidium. Puits M, le marqueur d'ADN pGEM®, puits 1, OmM Mg2+, puits 2, 0,5mM Mg2+, puits 3, 1mM Mg2+, puits 4, 1,5mM Mg2+, puis 5, 2mM Mg2+, puits 6, 2,5mM Mg2+, puits 7, 3mM Mg2+ et puits 8, 3,5mM Mg2+.
5/ Visualisation des produits PCR
Si vous ne détectez pas le produit d'une réaction PCR, la première variable à contrôler est la sensibilité de votre méthode de détection. Des quantités d'ADN inférieures à 10ng ne sont pas facilement détectées en coloration par le bromure d'éthidium. Il est possible de jouer sur la durée de l'exposition en photographiant le gel ou/et de décolorer le gel pour diminuer le bruit de fond fluorescent.
6/ RT-PCR
Quelle est la quantité d'ARN nécessaire pour amplifier un message rare (1à10copies par cellule) en utilisant la RT-PCR?
En moyenne, une cellule de mammifère contient 10pg d'ARN cytoplasmique.
Ainsi, 1µg d'ARN cellulaire correspond à l'ARN de 100000cellules.
1µg d'ARN cytoplasmique devrait contenir environ 100000copies de la plupart des messages rares, quantité facilement détectable en RT-PCR.
7/ Clonage T-A
Les vecteurs-T sont couramment utilisés pour clôner les produits PCR obtenus avec des enzymes, telles que la Taq polymérase, qui génèrent des fragments d'ADN avec des extrémités A. L'efficacité de clonage avec un vecteur-T est accrue lorsque la température de ligation est basse, de l'ordre de 4°C. Des températures plus élevées favoriseront des ligations "blunt-end" à l'origine d'un bruit de fond élevé de colonies ne contenant pas l'insert désiré.
8/ Traduction in vitro
Pour des produits PCR destinés à être traduits in vitro, il est conseillé d'utiliser, lors de la précipitation finale de l'ADN, de l'acétate de sodium plutôt que de l'acétate d'ammonium. En effet, l'excès d'ions ammonium peut diminuer l'efficacité de traduction.
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