Janvier 1998 - n°24
Introduction
Depuis sa description en 1985 et la découverte de la Taq DNA Polymérase thermorésistante, la PCR a totalement révolutionné les méthodes d'analyse moléculaire. A tel point que cette dernière est aujourd'hui appliquée à l'étude de la quasi totalité des organismes (virus, bactéries, parasites, plantes, cellules et tissus animaux et humains). De plus la PCR a été depuis 1988 déclinée en une multitude de variantes dont la liste ne cesse de s'allonger chaque jour: RT-PCR, PCR-Multiplex, PCR-in Situ, AP-PCR, RAPD,...
Toute mise au point d'une réaction PCR, nécessite l'optimisation préalable des conditions de la réaction afin de parvenir à l'amplification sélective du fragment recherché. Nous soulignerons quelques uns des éléments déterminants de la réussite d'une réaction d'amplification par PCR. Pour des raisons de simplification, nous ne considérerons ici que des réactions d'amplification à partir d'ADN génomique et non d'ADNc.
1- Qualité et quantité d'ADN matriciel
L'usage qui sera fait de l'ADN (stockage ou non) et la nature du prélèvement conditionnent souvent le protocole de préparation qui sera utilisé. Néanmoins, le pré-requis à toute amplification, est que l'ADN utilisé comme matrice soit débarrassé d'inhibiteurs potentiels de la PCR. La Taq polymérase, enzyme thermorésistante, présente en effet des sensibilités variables à certains agents chimiques et biologiques (cf. tableau et figure n°1). Ces inhibiteurs proviennent soit de l'échantillon, soit des réactifs utilisés dans les protocoles d'extraction et de conservation.
Figure 1: amplification par PCR en absence et présence des concentrations indiquées d'impuretés. M: Marqueurs; SDS: gène d'une protéine de prion (0.75Kb); Phenol: gène BRCA1 (0.9 kb); Ethanol: gène du récepteur à l'interleukine 9 (0.5 Kb); AcNa: gène N-Ras (1 Kb); NaCl: gène CFTR (1.5 Kb); EDTA: gène hugl-2 (1.1 Kb)
Si dans l'absolu, une copie du gène recherché est suffisante pour obtenir son amplification, dans la pratique plusieurs copies sont souvent nécessaires. La quantité utilisée d'ADN, peut influer sur le résultat d'amplification, une quantité insuffisante d'ADN ne permettant pas d'obtenir d'amplification, alors qu'une quantité trop importante d'ADN peut conduire à la génération de signaux aspécifiques. A titre indicatif, dans le tableau suivant figure pour différents génomes, le ratio entre quantité d'ADN et nombre de copie d'un gène monocopie.
2- Qualité et Quantité des amorces
La réaction PCR nécessite l'hybridation d'amorces spécifiques sur la séquence que l'on souhaite amplifier. Cette hybridation spécifique est conditionnée notamment par la qualité et la quantité des amorces utilisées. En effet si le ratio matrice-amorce est important, la séquence de ces dernières est tout aussi déterminante.
Dans le tableau ci-après figurent quelques uns des critères de choix des amorces ainsi qu'une indication sur les quantités à utiliser.
Différents logiciels tels Amplify, C.Primer sont disponibles sur Internet pour le calcul des Tm et la recherche d'homologies de séquences inter-amorces.
Figure 2: Amplification en parallèle d'un fragment de 1.5Kb du gène CFTR avec 2paires d'amorces. M: marqueur; puits1 et2 duplica avec amorces correctes; puits3 et4 duplica avec des amorces présentant une complémentarité de séquence sur 4bases à l'extrémité 3'.
3- Les tampons de PCR 10X et la concentration en MgCl2
Les éléments constitutifs des tampons x10 les plus communément utilisés sont:
* Tris.Cl: 100 à 670 mM, pH: 8,3
qui sert à tamponner le milieu réactionnel au niveau optimal pour l'activité de la Taq DNA polymérase
* MgCl2: 150 à 300 mM
l'ion Mg2+ est un cofacteur essentiel de la Taq Polymérase. Ce cation bivalent interagit également avec les charges négatives de la chaîne d'ADN, limitant ainsi les forces de répulsion entre brins d'ADN et favorisant donc la stabilité de l'hybridation. Plus sa concentration est importante, plus l'hybridation est facilitée que celle-ci soit spécifique ou non. Une trop forte concentration peut alors conduire à une augmentation des signaux aspécifiques.
* KCl 500 mM ou (NH4)2 SO4 160 mM
K+ et NH4+ sont des cations monovalents capables d'interagir avec les charges négatives de l'ADN de la même manière que le Mg2+. Dans les conditions de la PCR, les ions NH4+, qui existent à la fois sous la forme d'ions ammonium et d'ammoniaque, peuvent interagir avec les liaisons hydrogènes. Cette interaction va "piéger" les liaisons hydrogènes faibles présentes dans les zones de mésappariement et ainsi défavoriser les hybridations non spécifiques.
Dernièrement, il a été montré (1) que l'utilisation combinée des 2ions monovalents K+ et NH4+ permet de maintenir un ratio élevé entre hybridation spécifique et non spécifique pour une large fenêtre de température d'hybridation et de concentration de MgCl2. Ceci a pour effet, de rendre l'activité de la Taq Polymérase moins dépendante de ces 2facteurs, ce qui réduit notablement les efforts d'optimisation.
Tampons avec Tampon avec un seul type
ions K+ + NH4+ d'ions K+ ou NH4+
Figure 3: Comparaison de l'efficacité d'amplification en présence des concentrations indiquée de MgCl2 dans un tampon combinant des ions K+ et NH4+ (à gauche) et dans un tampon ne contenant qu'une seule sorte d'ions monovalent K+ ou NH4+ (à droite)
4- La Température d'hybridation
Pour le choix de la température d'hybridation il est souvent recommandé de se placer à une température inférieure de 4 - 5°C au Tm du couple d'amorce (si ce Tm est différent pour les 2amorces, prendre le Tm le plus bas comme point de référence). Une autre approche plus empirique et qui donne souvent de bons résultats avec des amorces >20mers (50% GC) est de choisir comme point de départ une température d'hybridation de 54°C, si des amplifications non spécifiques sont observées augmenter alors par paliers de 2°C la température d'hybridation.
De même manière que la concentration en MgCl2, la température d'hybridation influence fortement la spécificité de l'amplification. La fenêtre de température optimale est bien souvent étroite (Cf Figure ci-dessous) et là encore, l'utilisation combinée des ions monovalents K+ et NH4+ permet d'atténuer l'incidence de ce facteur (1). Ceci autorise l'utilisation simultanée d'amorces de Tm différents (PCR multiplex) et facilite la mise au point des réactions.
Figure 4: Comparaison de l'efficacité d'amplification à différentes températures d'hybridation dans un tampon combinant des ions K+ et NH4+ (à gauche) et dans un tampon ne contenant qu'une seule sorte d'ions monovalent K+ ou NH4+ (à droite).
5- La Qualité et quantité de Taq Polymérase
Le tableau suivant résume les caractéristiques de l'enzyme Taq DNA Polymérase de Thermus aquaticus.
Il est préférable de travailler avec une enzyme recombinante et non native, celles ci sont souvent de meilleure qualité car produite en plus grande quantité, elle est moins sujette au risque de contamination par des Endonucléases et Protéases.
Pour ce qui est des quantités d'enzymes à utiliser, les protocoles standards recommandent 2.5U/100µl de PCR, différents auteurs rapportent des résultats équivalents avec2 voire 1 U/100µl de PCR. Il est néanmoins déconseillé de travailler avec moins d'une unité par réaction.
6- Utilisation d'adjuvants de type DMSO, glycérol, BSA, Tween-20
Il est de pratique courante d'utiliser des adjuvants du type DMSO, glycérol, détergents pour l'optimisation des PCR sur matrices d'ADN riches en bases GC difficiles à dénaturer. Ces réactifs améliorent la dénaturation de ces matrices en facilitant la rupture des liaisons hydrogènes reliant les 2brins de la molécule d'ADN. Le DMSO est souvent utilisé à des concentrations finales de 5à10% (v/v), mais il a été rapporté qu'à ces concentrations le DMSO inhibait l'activité de la Taq d'où la nécessité d'utiliser plus d'enzyme. Il en est de même pour le glycérol souvent utilisé à 5%. La BSA utilisée à des concentrations de 0.2 à 0.8µg/µl donne pour certains systèmes de bons résultats. Dernièrement, une nouvelle génération d'adjuvant ne présentant pas d'effet inhibiteur sur la Taq DNA Polymérase a été développé pour l'amplification des régions difficiles ou riches en G-C (1). (Cf Figure 5: ci-dessous pour un exemple: D = DMSO; Q: nouvel adjuvant).
Conclusion
En l'espace d'une décennie, la PCR s'est imposée comme une technologie particulièrement performante et accessible pour un grand nombre d'applications et de développements. Comme nous l'avons vu ce formidable outil nécessite toutefois la prise en considération d'un certain nombre de facteurs tels que: l'absence d'inhibiteurs, la qualité des amorces, le milieu réactionnel, la qualité de l'enzyme...
La qualité croissante des enzymes commercialisées et l'apparition de nouveaux tampons et adjuvants facilitent notablement la mise en œuvre de cette technologie. L'utilisation de "Master-Mix", mélanges pré-établis de l'enzyme et du milieu réactionnel facilite encore le travail au quotidien et minimise les risques liés aux étapes de pipetage.
L'utilisation de Taq Polymérase modifiées, "Long-Range", "Hot-Start" et "High-Fidelity" améliore la qualité des résultats et accroit les champs d'applications possibles de cette technologie.
Farida MEBARKI, Resp. Support Technique
Société QIAGEN S.A.