Avril 2002 - n°67
Purification à grand
débit des oligonucléotides "Trytil-on"
Contact :
Varian SA services consommables
Florence NEVEU
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fax : 01 69 86 38 94
email : florence.neveu@varianinc.com
- www.varianinc.com
Cette dernière décennie, les oligonucléotides synthétiques ont retenu toute l'attention des chercheurs comme outils biochimiques de la biologie moléculaire moderne, par exemple comme précurseurs dans la technique PCR (Polymerase Chain Reaction) de fabrication des gènes synthétiques pour la recherche sur les mutations génétiques causées par des configurations locales des gènes. Grâce à leur capacité de reconnaissance spécifique d'une séquence ADN ou ARN, ils peuvent aussi être utilisés comme sonde pour le diagnostic prénatal des anomalies génétiques. Par conséquent, la demande d'oligonucléotides purs et en plus grandes quantités a considérablement augmenté ces dernières années.
Problèmes liés à la synthèse des oligonucléotides
La synthèse moderne, en phase solide
des oligonucléotides est basée sur la chimie des phosphoramidites
associée à de puissants synthétiseurs d'ADN. Cette voie
chimique comporte de nombreuses étapes qui commencent par l'accrochage
du groupe 3‘-hydroxyle du premier nucléoside sur un support constitué
soit de verre à porosité contrôlée dit CPG (controlled
pore glass) soit d'un copolymère polystyrène. L'oligonucléotide
est synthétisé dans la direction 3‘ vers 5‘ et un
cycle élémentaire de synthèse (ajout d'un nucléotide)
comprend les étapes suivantes :
1. Détritylation.
2. Couplage.
3. Protection (capping).
4. Oxydation.
Après oxydation, la synthèse des nucléotides peut continuer
par l'élimination du groupe trityle de la position 5‘ en fin de
chaîne traitée et répétition d'un cycle d'ajout de
nucléotide. Le traitement final post-synthèse comprend l'élimination
complète du support solide (déprotection) à l'aide d'une
solution d'ammoniaque, la mesure du rendement (en unités DO), les étapes
de déminéralisation ("désalage") et de purification.
Pendant la synthèse des oligonucléotides, une quantité non négligeable de séquences indésirables appelées séquences erronées trityl-off et trityl-on s'accumulent. Ces séquences tronquées apparaissent à la suite d'un couplage incomplet (trityl-off ), d'une détritylation incomplète ou d'une protection imparfaite (trityl-on), elles constituent la principale source d'impuretés. Les défauts des séquences trityl-on produisent des oligonucléotides plus courts que la longueur prévue. En conséquence, après la synthèse en phase solide, le mélange brut contient les oligonucléotides de longueur voulue, des oligochaînes tronquées ou modifiées par voie basique, et une faible quantité de produits de réactions secondaires ainsi que des sels d'ammonium étrangers. Ces impuretés doivent être éliminées lors des états de purification.
La quantité d'impuretés tolérée dans le mélange synthétique varie en fonction de l'utilisation prévue. En règle générale, plus la longueur des nucléotides synthétisés augmente, plus la quantité de nucléotides complets dans le produit final diminue. La déminéralisation par filtration sur gel constitue une option de nettoyage rapide, bon marché utilisée pour la production des oligonucléotides dans les applications biologiques standard comme les PCR, le séquençage, etc. et peut parvenir à une pureté de 70 %. Des puretés supérieures peuvent être obtenues en mode trityl-on (dernier groupement DMTr conservé) et trityl-off (dernier groupement DMTr éliminé).
La purification PAGE conduit à des puretés
supérieures au prix d'une technique très complexe. La CLHP en
phase inverse donne le meilleur niveau de pureté (> 95 %) et peut
être utilisée à l'échelle préparative. Cependant,
la CLHP est coûteuse et son débit est relativement faible, elle
est limitée aux oligos comportant moins de 50 bases. L'extraction en
phase solide (SPE) élimine les séquences tronquées et conduit
à une pureté moyenne mais à des débits supérieurs
à ceux obtenus en CLHP et PAGE.
Pour analyser la pureté des oligonucléotides, la technique de
choix est l'électrophorèse capillaire (CE) couplée à
la spectrométrie de masse.
TOP VersaPlate : Une méthode simple, peu coûteuse et à grand débit pour la purification des oligonucléotides Trityl-on
Le système de cartouches TOP (Trityl-on Oligonucleotide Purification) de Varian est simple, rapide et d'un meilleur rapport qualité/prix que les produits courants destinés à la purification trityl-on sur cartouches. Le système TOP comprend les fameuses microplaques 96 puits VersaPlate à tubes amovibles, une procédure d'écoulement par gravité rationalisée et une résine polymérique unique. Avec des tubes de résine de 25 ou 50 mg, cette technologie innovante atteint des rendements et une pureté supérieurs pour les oligonucléotides standard pour des quantités de 5 à 200 nmoles et une longueur pouvant atteindre 50 mers.
Le système TOP permet d'atteindre des rendements supérieurs sur une grande gamme de longueurs (15-50 mers) et d'échelles (5-200 nmoles) d'oligochaînes. Le rendement moyen pour des oligos de 25 mers purifiés avec le système TOP et le protocole conduisant au rendement maximal est de 7 unité DO pour une synthèse de 50 nmoles et de 15 unités DO pour une synthèse de 200 nmoles. Le pourcentage de récupération moyenne des oligos purifiés par rapport à l'échantillon brut déprotégé dépasse 60 %, cela implique une liaison excellente et une élution des oligochaînes complètes.
Le système TOP de Varian permet d'obtenir plus de 90 % d'oligochaînes complètes et est idéal pour les applications nécessitant des ADN de haute qualité. Le TOP élimine efficacement les séquences tronquées ne contenant pas un groupement DMTr en position 5‘ ainsi que les sels de déprotection en solution et les sous-produits.
Protocole TOP et stratégie de purification
Le système TOP repose sur le principe
de la chromatographie en phase inverse. Les oligonucléotides purifiés
par ce système sont du type trityl-on (dernier groupement DMTr conservé).
Le groupement DMTr de la position terminale 5‘ est hydrophobique ce qui
permet une meilleure rétention de l'oligo complet en comparaison des
chaînes tronquées qui ne contiennent pas de groupement trityle.
Ils sont par conséquent éliminés du tube avec un rinçage
à faible pourcentage d'acétonitrile. La solution d'ammoniaque
fortement basique et les groupements de protection betacyano clivés sont
élués directement sur la colonne après l'ajout de l'échantillon
sur le tube TOP. Il est important de noter que le TOP élimine les étapes
récurrentes d'application de l'échantillon grâce à
l'effet liant de l'oligo sur la résine polymérique. Cela économise
encore plus de temps. Après rinçage, les oligonucléotides
retenus sont détritylés sur la colonne au moyen d'acide trifluoracétique
(TFA) en éliminant le groupement trityle qui se dégrade en pH
acide. L'acide résiduel est éliminé du tube par deux rinçages.
Les oligos complets sont alors purifiés avec un éluant aqueux
à 50 % d'acétonitrile.
Ci-dessous, figure un résumé de la méthode, il est valable
pour les tubes TOP pour 50 et 200 nmoles.
| Prétraitement de l'échantillon | Ajouter à l'échantillon
déprotégé un volume égal de tampon liant (volume
total maximal : 2 ml). |
| Conditionnement | Ajouter 500 µl d'acétonitrile 100 %. Ajouter 500 µl d'une solution de TEAA 0,1 M. |
| Dépôt de l'échantillon | Ajouter l'échantillon prétraité,
par aliquots de1 ml. |
| Purification* | Ajouter 1 ml d'un mélange d'acétonitrile
/ TEAA 0,1 en proportions 15/85 v/v. |
| Détritylation | Ajouter 1 ml d'une solution de TEAA à 2 %. |
| Rinçage 1 | Ajouter 1 ml d'une solution de TEAA 0,1 M. |
| Rinçage 2 | Ajouter 1 ml d'eau. |
| Plaque de collection | Placer la plaque de collection au-dessous de la plaque
TOP. |
| Élution | Ajouter 500 µL d'un mélange eau/acétonitrile
50/50 v/v. |
* Pour améliorer la
pureté, augmenter le pourcentage d'acétonitrile jusqu'à
la proportion 20/80 v/v acétonitrile / TEAA à 0,1M. |
|
Les avantages du système TOP :
Meilleure productivité
- Purification manuelle de 96 oligos maxi. en quarante-cinq minutes.
- Traitement de plus de 1000 oligos par jour à l'aide d'une station robotisée.
- Économie de temps grâce à une indisponibilité réduite
du séchage post-purification.
Purification des oligonucléotides sans effort, rendement élevé et haute pureté.
- Rendement reproductible grâce au débit gravitationnel.
- Ajout direct de la solution de déprotection AMA / ammoniaque.
- Élimination des étapes récurrentes de dépôt
de l'échantillon.
Système économique
- Réduction des coûts globaux.
- Réduction des coûts de réactifs et de gaspillage rapport
aux plaques de microtitration monolithiques.
- Réduction des coûts de 30 % par oligo avec l'utilisation optionnel
des tubes individuels et de la plaque de base VersaPlate réutilisables
Kit de démarrage
Varian propose un kit de démarrage TOP pour simplifier la préparation et le processus de traitement. Deux solutions prêtes à l'emploi sont disponibles – pour des quantités synthétisées de 50 et de 200 nmoles.