Mars 2004 - n°86

La stérilisation à air chaud à 180°C : le seul moyen efficace contre une contamination microbienne dans les incubateurs à CO2

Angélique Naud de Binder GmbH

La culture des cellules et des tissus demande des conditions de travail absolument stériles. Parmi les problèmes qui peuvent survenir lors de cultures in vitro, il y a la contamination microbienne. D’importantes lignées de cellules sont alors irréversiblement endommagées et des travaux coûteux sont anéantis. Dans ce même contexte il faudrait aussi poser un regard critique sur les incubateurs à culture de tissus et de cellules. Les constructeurs de tels appareils proposent diverses techniques dans le domaine de la décontamination des incubateurs à CO2. D’importantes différences existent cependant entre ces divers systèmes quant à leur efficacité. La seule méthode fiable et le seul procédé conforme aux normes en vigueur pour une décontamination efficace est la stérilisation à air chaud.
Celle-ci est rarement disponible sur les incubateurs à CO2 habituels, elle l’est sur les incubateurs Binder, série CB.

Des consignes et normes de sécurité de plus en plus strictes.

Les nouveaux domaines d’application, tels que la recherche sur le remplacement cellulaire et tissulaire dans le domaine de la médecine régénérative, ont largement contribué à une modification fondamentale des exigences techniques auxquelles doivent répondre les incubateurs à CO2. Outre les réglages extrêmement précis des températures et de la régulation dynamique du CO2 ((Distler, GIT Labor-Fachzeitschrift 7/2002 (1)), des aspects tels que l’absence des germes et un milieu stérile de croissance dans des incubateurs à CO2 sont de plus en plus importants. La condition pour un travail sécurisé sur la base GLP/GMP conforme au processus de travail est un milieu de culture stérile pour tous les travaux in vitro et en particulier en ce qui concerne la manipulation de cellules humaines.

Des mesures d’hygiène maximales réduisent considérablement les risques et contribuent à la sécurité du processus. Dans le domaine de la médecine régénérative, ce n’est pas seulement le scientifique qui profite de ces mesures mais plus particulièrement le patient directement concerné (par exemple dans la multiplication de cellules cartilagineuses). Dans le cas de culture de matériel cellulaire humain, les mêmes consignes de sécurité que pour la manipulation de préparations sanguines sont à respecter, afin d’éviter tout risque de contamination (hépatite, HIV, etc)

De la simple désinfection à la méthode de stérilisation à 180°C à air chaud fiable et conforme aux normes éprouvées.

Aujourd’hui le marché des incubateurs à CO2 offre une solution adaptée à toutes les demandes relatives à la qualité de culture et à la sécurité des processus (stérilité du milieu de culture) : la gamme des produits proposés va de l’appareil le plus simple sans aucun dispositif de prévention de contaminations, voire sans aucune possibilité d’élimination des germes jusqu'aux incubateurs de haute technologie qui permettent une stérilisation conforme aux normes par air chaud à 180°C. Entre les deux extrêmes il existe des compromis technologiques. En ce qui concerne leur efficacité, ces procédés qu’il s’agit d’appeler des méthodes de désinfection, fonctionnent sur des principes divers. Hormis leur principe de fonctionnement, l’efficacité de ces procédés est aussi très variable. La réduction des germes par désinfection n’est pas comparable avec la technique complexe mise en œuvre dans la stérilisation à air chaud à 180°C. C’est le seul procédé fiable défini par la norme DIN 58947(2) et reconnu sur le plan international pour une décontamination efficace conforme aux normes.

Une simple désinfection est-elle suffisante pour sécuriser les procédés de culture ?

Les méthodes les plus répandues de désinfection ou les mesures préventives contre une contamination microbienne des incubateurs à CO2 sont l’irradiation par UV, le recyclage permanent de l’air par filtre HEPA et la désinfection à air chaud humide. Les métaux comme le cuivre ou des alliages contenant du cuivre ont un effet bactéricide supplémentaire. Il existe évidement une corrélation entre la sécurité des procédés, c’est à dire le risque de contamination de l’incubateur à CO2 et le degré d’efficacité de la méthode de décontamination intégré à l’appareil. Pour les incubateurs à CO2 simples n’ayant pas de dispositif de prévention, le risque de contamination est le plus important. En cas de contamination par des germes susceptibles de produire des spores, cela peut dans des cas extrêmes signifier le remplacement de l’incubateur.

Des directives très strictes pour la stérilisation thermique conformément à la norme DIN 58947

Les systèmes qui intègrent les méthodes de désinfection par irradiation UV, par recyclage d’air avec filtration permanente HEPA ou la désinfection par chaleur humide assurent une sécurité très limitée. D’après les directives très strictes de la norme DIN 58947 partie 3 ou du Bundesgesundheitsblatt 22, n°10(3), concernant la stérilisation thermique, ces méthodes ne sont pas suffisantes. L’irradiation par rayons UV mutagènes n’est, par exemple, pas homogène dans tout l’incubateur. De même pour les incubateurs avec filtres HEPA, il n’est pas exclu que des contaminations se développent dans des zones de l’incubateur non accessibles par cette méthode. Les causes en sont le vieillissement rapide des matériaux filtrants et un entretien des filtres souvent mal effectué car coûteux et long. Une désinfection à 90°C et à hygrométrie élevée n’offre également qu’une sécurité limitée et ne présente donc qu’une solution de compromis. On peut trouver ce procédé sur le marché sous le nom trompeur de " stérilisation douce ". Cette méthode visant à réduire les germes est basée sur l’action thermique de la chaleur humide à environ 90°C pendant plusieurs heures.

Résultat d’une étude menée par un organisme indépendant : effets limités de la désinfection à 90°C / chaleur humide.

Une étude comparée a été menée dans un laboratoire de contrôle neutre de renommée internationale et accrédité bénéficiant de la norme ISO/IEC 17025. Il s’agit d’une étude comparée de deux incubateurs, l’un à stérilisation par air chaud à 180°C (Binder CB, schéma 1 et 2), l’autre un incubateur à CO2 avec décontamination à 90°C. Le but de cette étude était de démontrer les performances qualitatives et quantitatives des deux procédés de décontamination dans les mêmes conditions d’essais. Les incubateurs à CO2 ont été contaminés de façon systématique et reproductible avec un nombre défini de germes de tests à des endroits comparables des incubateurs, à savoir les parois intérieures haute et basse, la porte intérieure et les parois latérales. Des germes végétaux ainsi que des spores issus de germes sporifères (voir tab. 1) standardisés, utilisés habituellement pour des tests microbiologiques des appareils médicaux et des autoclaves, ont été employés comme germes tests. Ces derniers ont été appliqués sous forme d’amas de spores, mais aussi individuellement pour contrôle. Conformément aux instructions données par les constructeurs, les incubateurs à CO2 ont été soumis au procédé de décontamination. Pour l’incubateur à CO2 de Binder, série CB, la stérilisation à 180°C est d’une heure, pour le modèle concurrent l’exposition à 90°C / chaleur humide est de 9 heures. Ensuite, le degré de destruction a été analysé par des prélèvements et mise en culture de tous les germes tests. En tenant compte des tests de contrôle et des résultats des tests répétés, la conclusion sur les performances des deux procédés était claire et sans appel.

La conclusion ne surprend pas : les spores ne peuvent pas être éliminés avec une désinfection à 90°C /chaleur humide.

La conclusion de cette étude comparée était prévisible. Le résultat d’une décontamination à 90°C/chaleur humide était insuffisant. Des formes de germes végétatifs ont certes été inactivées, en revanche les formes de spores du genre de Bacillus subtilis et Bacillus stearothermophilus sensiblement plus résistant à la désinfection sont restés pratiquement intacts (voir tabl.2). Dans l’incubateur utilisant le procédé de stérilisation à air chaud conforme aux normes, tous les germes de tests végétatifs ainsi que les spores ont été complètement éliminés comme prévu (voir tabl.2). L’objectif d’une élimination totale des germes dans l’incubateur avec désinfection à 90°C/chaleur humide n’a donc pas été atteint. Ce résultat était reproductible par plusieurs tests et était le même pour toutes les zones de tests dans l’incubateur. De ce fait le résultat de ce test est en totale contradiction avec l’opinion largement répandue de la soit disant fiabilité de ce procédé. Ces résultats sont surtout en contradiction totale avec les documentations qui prouveraient scientifiquement, en se référant à des tests microbiologiques, l’efficacité de ce procédé. Cette divergence réside sans doute dans le fait que lors des tests précédents ce ne sont pas des spores qui ont été utilisées, mais des formes végétatives largement plus sensibles.

Conclusion

La destruction de germes par désinfection à 90°C/chaleur humide n’est qualitativement pas comparable à la stérilisation à air chaud à 180°C. Même avec des temps d’exposition très longs, ce procédé reste inadapté et insuffisant pour garantir un milieu stérile conformément à la réglementation en vigueur. C’est ce qui est confirmé par cette étude menée par un laboratoire d’analyses certifié.

Lors de cette étude des spores et des germes ont été utilisés qui, conformément à la norme DIN 58947, sont employés pour le contrôle des appareils médicaux et des autoclaves. Ce procédé de désinfection à 90°C/chaleur humide ne répond pas aux exigences extrêmes en matière de sécurité des milieux de culture et en matière de stérilisation, notamment dans des conditions GLP/GMP.

La stérilisation à air chaud à 180°C est la seule méthode fiable et internationalement reconnue pour la culture extrêmement exigeante de cellules dans des conditions GLP/GMP. Pour les manipulations dangereuses des cultures de cellules des virus et des bactéries pathogènes, la stérilisation à air chaud à 180°C garantit une sécurité inégalable. De plus ce procédé présente l’avantage considérable d’un gain de temps de plusieurs heures et de ce fait d’argent par rapport au long procédé de désinfection thermique à 90°C/chaleur humide. La sécurité et la qualité maximale de procédé pour la culture de cellules en incubateurs à CO2 sont conditionnées par d’autres aspects. Il s’agit d’avoir une précision extrême des températures, une dynamique exemplaire dans la régulation du CO2 et de la température, ainsi que les régulateurs les plus modernes pour une commande et une surveillance optimales des processus. Les incubateurs à CO2 Binder disposent de toutes ces qualités et fournissent à l’utilisateur les conditions parfaites pour un résultat de culture optimal.

Bibliograhie :
1) P. Distler (2002), GIT Labor-Fachzeitschrift 7, 801- 803
2) DIN 58947, Stérilisation – stérilisation à air chaud, 1990
3) Bundesgesundheitsblatt (1979), 22 Nr. 10, 193-200