Octobre 2004 - n°92

La Triple Détection en chromatographie d’exclusion stérique pour caractériser les polymères, les macromolécules, et les protéines

par Sandrine Olivier de Viscotek Europe Agence Francophone

La chromatographie d’exclusion stérique ou à perméation de gel (GPC/SEC ou CES) fait partie des techniques analytiques les plus courantes du laboratoire en caractérisation de polymères. Cette technique chromatographique sépare l’échantillon de polymère en fractions en fonction de son volume hydrodynamique. Grâce à un détecteur de concentration, souvent un réfractomètre, on établit pour cet échantillon un graphe représentant la fraction massique en fonction du volume d’élution. La manière d’exploiter ce chromatogramme de concentration en données utiles repose au cœur de la GPC.

En GPC conventionnelle, des polymères standards sont analysés et utilisés tels des marqueurs de masse moléculaire afin de calculer une distribution de masse relative pour l’échantillon. Cette approche a l’avantage d’être relativement simple, avec le minimum d’équipement, mais a le désavantage important de donner uniquement des valeurs de masse relative, affectées par la nature chimique et la structure du polymère (linéaire, branché…).

La GPC Triple Détection, ou SEC3, est un des progrès les plus significatifs de cette technique depuis ses débuts dans les années 60. La Triple Détection a transformé les capacités de la GPC, d’une méthode mesurant uniquement la masse moléculaire relative du polymère en un outil complet de caractérisation du polymère.

En GPC Triple Détection, 2 autres détecteurs sont ajoutés au détecteur de concentration : un détecteur de diffusion de lumière (statique) et un viscosimètre. Chaque détecteur apporte une information indépendante qui est exploitée en Triple Détection pour déterminer avec exactitude la masse moléculaire, la taille moléculaire et la viscosité intrinsèque sur toute la distribution du polymère. Nous allons expliquer comment ces informations sont obtenues et pourquoi la Triple Détection est un outil si complet et à fort potentiel.

Mesure de la masse moléculaire par détecteur de diffusion de lumière statique (DdL)

En analyse GPC de routine, essentiellement 2 approches, par extrapolation ou par calcul,étaient utilisées pour convertir le signal du détecteur en masse moléculaire vraie (ou " absolue "). En effet, l’intensité de la lumière diffuse est fonction de la masse du polymère mais aussi de l’angle de mesure. Cette dépendance angulaire de la lumière diffuse est une fonction non linéaire, croissant avec la taille moléculaire. Aux très petits angles de mesure (<10°), cette dépendance angulaire n’est pas observée.
Aujourd’hui, un détecteur novateur à angle de mesure à 7° du faisceau incident (Low Angle Light Scattering ou LALS) permet de réaliser la mesure facilement et de la convertir en masse moléculaire directement sans extrapolation ni calcul. La terminologie d’ " absolue " peut être utilisée plus correctement dans le cas du LALS où il n’y a ni extrapolation, ni calcul pour aboutir à la masse.

Mesure de la viscosité intrinsèque

Même si plus difficile à comprendre, le paramètre de viscosité intrinsèque est aussi important que la masse moléculaire dans la description de la molécule de polymère. L’unité est le dl/g, montrant qu’il s’agit d’une mesure volumétrique.
En pratique, la viscosité intrinsèque est liée à l’inverse de la densité du polymère en solution. Un polymère enroulé de façon très compacte, telle une protéine native, aura une forte densité en solution, et donc une faible viscosité intrinsèque. A l’inverse, pour une masse moléculaire donnée, un polymère synthétique classique avec une structure de type bobine aura une viscosité intrinsèque 10 fois plus élevée qu’une protéine.
De nombreuses modifications structurales ou de conformation transparaissent dans la valeur de viscosité intrinsèque. Celles-là incluent les ramifications et agrégats. Il en résulte que si les variations de viscosité intrinsèque peuvent être mesurées alors ces modifications structurales et de conformation peuvent être étudiées voire quantifiées.

Détermination de la taille moléculaire

La connaissance de la taille moléculaire du polymère en solution est une information clé pour les polymères synthétique ou naturel. Deux types de mesure sont couramment utilisées : rayon de giration (Rg) et rayon hydrodynamique (Rh). Les 2 peuvent être obtenus en GPC de façon plus ou moins exacte suivant la méthode utilisée.

Tandis que Rg est assimilé à un moment mathématique, Rh est basé sur une mesure réelle du volume occupé en solution, et peut être déterminé avec exactitude sans limite inférieure par GPC Triple Détection. Rh est calculé à partir du produit de la masse moléculaire et de la viscosité intrinsèque, chacuneétant obtenue avec exactitude par le LALS et le viscosimètre.

Exemple d’analyse structurale

Dans la mesure où les valeurs de viscosité intrinsèque et de masse moléculaire sont obtenues sur toute la distribution du polymère,
les résultats peuvent être exploités pour étudier la structure moléculaire du polymère. L’étude du branching de polycarbonates va illustrer cela.
Les polycarbonates sont des polymères techniques aux propriétés particulières comme la transparence, une forte rigidité, ou une résistance aux radiation utilisés dans de nombreuses applications dont en électronique et dans l’industrie automobile. Ils ont des masses s’échelonnant de 10kDa 200kDa avec des degrés de branching variables. Le degré de branching ayant une influence sur les propriétés finales du matériau, l’analyse et le contrôle minutieux de ce branching est très important.

Deux échantillons de polycarbonates (PC1 et PC2) dont l’un linéaire, l’autre faiblement ramifié, ont été analysés par GPC Triple Détection afin de quantifier le taux de ramification. Les distributions en masse des 2 polycarbonates montraient des différences en masse mais n’informaient aucunement sur les différences de structure. Pour étudier la structure, le diagramme de Mark-Houwink est utilisé . Ce diagramme qui représente la viscosité intrinsèque en fonction de la masse montre clairement une différence entre les 2 polycarbonates due au branching. L’échantillon PC1 étant en dessous de celui de PC2, sa densité est plus importante que le PC2 (linéaire) quelle que soit la masse. Le nombre de ramifications sur la distribution est calculé grâce aux rapports des valeurs de viscosité intrinsèque pour les 2 échantillons.
Même si cette information est intéressante et utile, l’augmentation du nombre de branches avec la masse moléculaire pouvaitêtre intuitivement prévisible. Pour observer l’évolution du nombre de ramifications en fonction de la masse du polymère, il est plus appropriée de déterminer la fréquence de ramification. Dans le cas de ces 2 polycarbonates, la fréquence de ramification, exprimée ici en nombre de branches par 100 000 Da, diminue avec l’augmentation de la masse moléculaire c’est à dire plus la chaîne est longue, plus la fréquence de branches le long du squelette du polycarbonate est faible.Cette fréquence peut être reliée à la synthèse et chimie de polymérisation. Ce cas est très différent des polyéthylènes par exemple, pour lesquels en général, la fréquence de ramification augmente avec la longueur de chaîne.

Cette étude des polycarbonates démontre que l’extrême sensibilité de la GPC Triple Détection a permis de détecter et même quantifier de faibles taux de ramification dans le polycarbonate.

Conclusion

La technique de GPC Triple Détection possède plusieurs avantages par rapportà la GPC conventionnelle, et même tout autre forme de GPC. L’ajout d’un viscosimètre et d’un détecteur de diffusion de lumière transforme le potentiel de la GPC en un outil analytique de caractérisation très pointu. La masse moléculaire est mesurée directement par le LALS ; la structure et les ramifications grâce au viscosimètre. Les différences de structure et de branching peuvent être détectées, quantifiées et associées aux propriétés du produit fini. Ni la diffusion de lumière ni le viscosimètre, ne pourraient faire ces mesures seuls. C’est la combinaison des détecteurs qui rend la GPC Triple Détection aussi complète.
La technique de GPC Triple Détection s’applique à tous les polymères et macromolécules synthétiques ou naturels, incluant les protéines et autres glycoconjugués.