Septembre 2006 - n°113
Extraction rapide et reproductible de l’acrylamide
dans les pommes de terre frites en utilisant un seul sorbant d’extraction
en phase solide (SPE) : le Strata™-X-C
Phenomenex SAS
Liming Peng, Tivadar Farkas, Lawrence Loo, James Teuscher, Krishna
Kallury
L’acrylamide (M = 71, Tfus =84,5 °C, log
P = 0,67), qui appartient à la classe de composés organiques
appelée « énamides », est un produit chimique industriel
extrêmement important. Les polymères et copolymères dérivés
de ce monomère, appelés « polyacrylamides », s’utilisent
dans des domaines très variés tels que la clarification de l’eau
potable, la floculation des eaux usées, la récupération
des hydrocarbures, l’amendement du sol, l’agriculture et les purifications
biomédicales. Cependant, la neurotoxicité de l’acrylamide
constitue un risque grave pour la santé et rend le public réticent
à accepter les polyacrylamides en tant que substances sans danger.1
Pour ajouter à ces préoccupations, on a détecté
la présence d’acrylamide dans des produits alimentaires préparés
à haute température.2,3
Les méthodes antérieures de détection de l’acrylamide
utilisaient une extraction liquideliquide suivie par une dérivatisation
(bromation) et une analyse par CG-DCE ou CGSM.4,5 Les seuils de
détection élevés associés à ces méthodes
au demeurant fastidieuses et laborieuses limitent leur applicabilité
à la détermination des faibles teneurs en acrylamide dans les
matrices alimentaires.
Des méthodes de détermination de la teneur en acrylamide récemment
publiées 6,7,8 utilisent successivement un ou deux sorbants
d’extraction en phase solide (SPE) pour préparer l’échantillon
avant la détection par LC/ MS. La méthode utilisant un seul
sorbant à phase inverse est basée sur une extraction en phase
solide non rétentive retirant seulement les composants hydrophobes
de l’échantillon tandis que l’acrylamide traverse le sorbant
sans être retenue. Une méthode d’extraction plus complète
nécessitant deux sorbants SPE a été proposée.
Cette méthode consiste à utiliser d’abord un sorbant hydrophile
et lipophile pour retirer la plupart des composants de l’échantillon,
puis à faire passer ce dernier à travers un second tube contenant
un sorbant en mode mixte qui raffine l’extraction de l’analyte
ciblé (à savoir l’acrylamide). Ces méthodes produisent
des extractions plus nettes à l’analyse, mais elles sont onéreuses
et prennent beaucoup de temps.
Cette note d’application présente une méthode simple et
efficace utilisant un seul sorbant SPE – le strata-X-C
– pour extraire l’acrylamide d’un échantillon alimentaire
(pommes de terre frites). Le strata-X-C est une résine polymère
révolutionnaire en instance de brevet qui a été fonctionnalisée
avec des groupements polaires à forte capacité d’échange
cationique. En conséquence, la résine strata-X-C présente
de nombreux mécanismes de rétention, tels que rétention
hydrophobe, rétention hydrophile, interactions π-π et échange
cationique fort, qui en font le moyen idéal pour extraire l’acrylamide
des échantillons alimentaires. Tous ces mécanismes de rétention
entrent en jeu pour extraire efficacement l’acrylamide de l’échantillon.
Instrumentation
HPLC : Agilent série 1100 (Palo Alto, Californie)
MS :
Analyseur SM à piège ionique Bruker Esquire 2000 (Billerica,
Massachusetts), APCI à source d’ions en mode MRM cationique (acrylamide
m/z : 72->55, acrylamide-d3 m/z : 75->58).
Colonnes :
Synergi™ Hydro-RP 4µm 250 x 3,0 mm (LC/MS)
Synergi™ Polar-RP® 4µm 150 x 4,6 mm (HPLC-UV)
Conditions expérimentales
Préparation des spécimens
Ajouter 50 ml d’eau à 10 g de pommes de terre frites surgelées
pulvérisées et mélanger ou homogénéiser
pendant 20 minutes. Centrifuger la solution décantée à
10 000 tr/min pendant 15 minutes. Ajouter l’étalon interne (acrylamide-d3)
à l’échantillon. Ajouter le surnageantà un tube
de strata-X-C traité comme indiqué ci-dessous.
Méthode d’extraction en phase solide
1. Conditionnement : ajouter 2 x 1 ml de méthanol
suivis de 2 x 1 ml d’eau au tube de strata-X-C à un débit
de 2 ml/min.
2. Ajout de l’échantillon : Ajouter le surnageant
(préparé comme indiqué ci-dessus) à un débit
inférieur à 0,5 ml/min.
3. Séchage : 30 secondes sous vide (250 à 300
mm Hg).
4. Élution : 1 ml d’eau à un débit
inférieur à 0,5 ml/min ; recueillir l’éluat dans
un flacon à échantillon ; extraire toute eau résiduelle
du sorbant en appliquant un vide total. Cet éluat est prêt pour
l’analyse LC/MS.
Important ! Les volumes recommandés sont donnés pour 100 mg
de masse de lit de sorbant. Les volumes devront être ajustés
pour les masses de sorbant inférieures ou supérieures.
Analyse
Une courbe d’étalonnage a été produite en
ajoutant de l’acrylamide et de l’acrylamided3 (tous deux en préparation
aqueuse) à différentes concentrations dans 1 ml de surnageant
de pommes de terre frites. Deux échantillons de surnageant non dopés
ont servi de témoins.
Résultats et discussion
Pour retenir un analyte polaire et hautement hydrosoluble (215,5 g/100
ml d’eau) tel que l’acrylamide avec un sorbant SPE, il est nécessaire
d’exploiter chaque mode d’interaction polaire possible. Il est
bien connu que les énamides peuvent être protonés avec
des acides de Brönsted pour former des cations N-acyliminium en solution.9,10
Ce comportement peut être utilisé pour retenir l’acrylamide
sur un sorbant échangeur de cations comme le strata-X-C, qui peut aussi
subir d’autres interactions polaires. Les groupements sulfoniques fortement
acides du strata-X-C peuvent fournir l’ion hydronium requis pour protoner
l’acrylamide, comme indiqué sur le schéma 1.
Schéma 1. Protonation de l’acrylamide par le
sorbant strata-X-C.
L’extraction de l’acrylamide peut s’effectuer au choix
avec un sorbant échangeur de cationsà base de silice ou de polymère.
Cependant, l’emploi du sorbant polymérique présente plusieurs
avantages. Premièrement, la résine strata-X-C présente
une plus grande surface (800 m2/g contre 500 m2/g) et
donc une capacité de rétention supérieure à celle
des substances à base de silice.
Deuxièmement, une surface polymérique présente une plus
grande concentration de groupements échangeurs d’ions qu’une
surface de silice. De plus, contrairement à la surface de silice, le
sorbant polymérique ne porte pas de groupements silanol. Cela est important,
car les groupements silanol interagissent avec les groupements sulfoniques
selon plusieurs mécanismes et empêchent ainsi une partie de ces
groupements d’interagir avec l’acrylamide.
L’évaluation comparative des sorbants Strata SCX et strata-X-C
montre que le produit SCX à base de silice extrait environ 50 % de
l’acrylamide, tandis que le sorbant polymérique strata-X-C en
extrait presque la totalité. Enfin, le sorbant polymérique offre
plus de modes de rétention pour répondre aux perturbations liées
à l’échantillon. Pour extraire l’acrylamide des
pommes de terre frites, il faut utiliser de l’eau, non seulement à
cause de la haute solubilité de l’acrylamide dans ce solvant,
mais également pour réduire au minimum la dissolution des molécules
hydrophobes dans ce produit alimentaire. De plus, lors du développement
d’un protocole SPE pour l’acrylamide, l’étape de
lavage doit être exclue en raison de sa solubilité dans l’eau.
L’élution à l’eau présente également
l’avantage d’éliminer la désorption de toutes les
impuretés hydrophobes, qui restent absorbées dans le sorbant.
Figure 1. Chromatogramme de CL-UV de l’acrylamide dans
un extrait de pommes de terre frites obtenu avec le strata-X-C.
Conditions CL : Synergi™ Polar-RP® 4µm 150 x 3,0 mm.
Phase mobile : Eau/Acétonitrile, 94/6 (v/v) à 0,4 ml/min.
Volume injecté : 10 µL.
Figure 2. Chromatogrammes CL-SM-SM des ions extraits pour
m/z : 72 ->55.
Conditions CL : Synergi™ Hydro-RP 4µm 250 x 3,0 mm
Phase mobile : eau/méthanol, 94/6 (v/v) (contenant tous deux 0,1 %
d’acide formique)à 0,5 ml/min.
Volume injecté : 25 µL
Comme le montre la figure 1, les chromatogrammes HPLC (UV)
enregistrés à 210 nm indiquent que l’extraction par le
sorbant strata-X-C donne des extractions nettes et faiblement bruitées
et un pic d’acrylamide bien distinct de ceux de tous les autres composants
de la matrice. La figure 2 présente le chromatogramme
d’échange d’ions pour la transition de l’ion moléculaire
protoné de l’acrylamide (m/z = 72) vers le cation acryloyle (m/z
= 55) par élimination du groupement NH3 (ammoniac). La phase mobile
de l’analyse LC/MS se composait d’eau et de méthanol à
96/4 et contenait 0,1 % d’acide formique. Les données de cette
figure montrent la haute sensibilité du mode de détection SM,
qui est capable de détecter l’acrylamide même à
l’état de traces. La reproductibilité de l’extraction
atteste d’une excellente précision à trois niveaux de
concentration différents (tableau 1).
Les taux de récupération absolus ont été déterminés
en comparant l’aire des pics des étalons de même niveau
et des extraits d’acrylamide dopés prélevés pour
servir de témoins. La linéarité a été étudiée
sur deux plages de concentration différentes : 10 à 500 ng/ml
d’acrylamide avec EI à 100 ng/ml voir figure 3)
et 100 à 2000 ng/ml avec EI à 500 ng/ml, comme indiqué
au tableau 1. La linéarité par rapport à
l’étalon externe a également été évaluée.
Les résultats indiquent une bonne linéarité dans tous
les cas avec R2>0,998.
Figure 3. Linéarité de l’extraction de
l’acrylamide par la méthode strata-X-C.
Courbe d’étalonnage préparée en ajoutant respectivement
10, 20, 50 (n=6), 100 et 500 (n=6) ng/ml d’acrylamide et 100 ng/ml d’EI
d’acrylamide-d3 dans 1 ml d’extrait de pommes de terre frites
à 0,2 g/ml.
Détection : CL-SM-SM.
Conclusions
La sélectivité innovante du sorbant strata-X-C permet d’extraire
rapidement l’acrylamide des pommes de terre frites en utilisant une
méthode simple et reproductible. Cette méthode utilisant un
seul sorbant SPE, elle constitue une solution intéressante pour remplacer
les méthodes utilisées ou proposées jusqu’à
présent pour extraire l’acrylamide des échantillons alimentaires.
La souplesse et la polyvalence de cette méthode d’extraction
permettent d’analyser la teneur en acrylamide des aliments à
des concentrations de l’ordre de 10-9 à 10-6 et de produire des
chromatogrammes relativement peu bruités. Elle élimine également
la nécessité de purger les colonnes, car la faible concentration
de sa phase mobile (pourcentage d’eau élevé) prévient
le dépôt des composants de l’échantillon.
Références bibliographiques
1. Caulfield et coll., Chem. Rev., 2002, 102, 3067.
2. Tareke et coll., Chem. Res. Toxicol., 2002, 13, 517.
3. Centre International de Recherche sur le Cancer, 1994, VI:60, 389.
4. Castle et coll., J. Sci Food Agric., 1991, 54, 549.
5. EPA (États-Unis), Méthode 8032A
6. Mann et coll. « Acrylamide Analysis Using LC-MS/MS », Waters
Corporation.
7. FDA (États-Unis), Center for Food Safety and Applied Nutrition,
Office of Plant& Dairy Foods & Beverages, « Detection and Quantitation
of Acrylamide in Foods », 23 juillet 2002
8. Kawata et coll., J. Chromatogr. A, 2001, 911, 75.
9. Wang et coll., J. Org. Chem., 2001, 66, 8215.
10. Speckamp et coll., Tetrahedron, 2000, 56, 3817.