Octobre 2006 - n°114

Sélection in vitro d’aptamères dirigés contre des structures ARN et des protéines

Fanny Vella, Laetitia Evadé, Jean-Jacques Toulmé et Eric Dausse
INSERM U386, Institut Européen de Chimie et Biologie

Des séquences ARN et ADN qui interagissent avec des cibles cellulaires (protéines ou ARN) peuvent être des outils utiles afin d’explorer les fonctions de l’ARN et des protéines dans différents types d’études, notamment dans la régulation de l’expression des gènes impliqués dans des processus pathologiques. Certaines de ces molécules inhibent particulièrement les fonctions biologiques des cibles et constituent, par conséquent, des candidats thérapeutiques potentiels pour le traitement de certaines maladies telles que des maladies virales humaines provoquées par le virus de l’immunodéficience humaine [par exemple, Darfeuille et al. 2004; Chaloin et al. 2005; Dausse et al. 2005; revu par Zhang et al. 2004] et le virus de l’hépatite C [par exemple, Aldaz-Carroll et al. 2002; Toulmé et al. 2003].

L’identification de séquences présentant une forte affinité pour des protéines d’intérêt diagnostique peut s’effectuer par la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Cette technique de sélection in vitro consiste à rechercher des séquences dans une banque d’oligonucléotides aléatoires (en général, environ 1015 espèces différentes). Cette méthode comprend différentes étapes dont l’incubation d’ARN ou d’ADN aléatoires avec la cible d’intérêt (1), la sélection des séquences qui ont reconnu cette cible (2,3), l’amplification de ces séquences par RT-PCR (4,5), puis leur transcription in vitro (6) (schéma de sélection in vitro). Ces étapes de sélection, amplification et transcription constituent un cycle de SELEX et doivent être répétées (environ 8-15 fois), jusqu’à ce que les candidats ARN/ADN présentant l’affinité la plus forte pour la cible soient isolés ; on appelle ces candidats des aptamères. Depuis une dizaine d’années, la méthode SELEX a été utilisée pour générer des aptamères dirigés contre des molécules-cibles de structure et de taille extrêmement variables telles que des acides nucléiques, des petites molécules organiques (ex : l’ATP) et des cibles plus complexes comme des récepteurs membranaires ou des cellules entières.

Manuellement, un cycle de SELEX prend deux à trois jours, et par conséquent, une sélection in vitro peut durer environ deux mois. Des techniques automatisées de sélection in vitro permettent d’optimiser ce temps et d’accroître la fiabilité et la reproductibilité du processus ; la première d’entre elles a été publiée par Cox et al. (1998). Récemment, à l’Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB) localisé à Bordeaux (France), nous avons développé de nouvelles techniques automatisées de sélection in vitro afin de sélectionner et d’identifier des aptamères en effectuant deux cycles de SELEX par jour. Ainsi la totalité d’une sélection in vitro peut se faire en huit à dix jours ; Deux sélections contre deux cibles différentes peuvent être menées en parallèle et nous espérons pouvoir doubler cette capacité de traitement dans un avenir proche.

A l’I.E.C.B, nous nous intéressons aux ligands oligonucléotidiques conçus de façon rationnelle (antisens, siARN) ou selon un processus combinatoire (SELEX). Les propriétés de fixation des oligonucléotides pour leurs cibles sont évaluées puis leur activité biologique est déterminée par des méthodes acellulaires et cellulaires. La sélection manuelle d’aptamères ADN ou ARN dirigés contre des motifs ARN structurés et les protéines a déjà été décrite auparavant (Dausse et al. 2005); la méthode automatisée a été développée en utilisant une plate-forme automatique de criblage, le Freedom EVO® 150 (Tecan). Cette plate-forme est équipée d’un bras robotique manipulateur et d’un bras de pipetage à huit canaux indépendants qui effectue l’aspiration et la distribution avec un mode de détection du niveau de liquide. Divers modules externes intégrés à la plate-forme permettent une automatisation totale du processus, incluant un module de séparation par billes magnétiques (Te-MagS™), un module de séparation sous vide (Te-VacS™), un agitateur orbital (Te-Shake™), un thermocycleur (MJ Research PTC-200), des hôtels de stockage pour microplaques et accessoires de laboratoire, des racks thermostatés pour réactifs (-20 et +4 ∞C) et microplaques, et des supports pour pointes de pipettes à usage unique. Les ligands candidats sont sélectionnés en fixant la cible biotinylée et sont capturés par des billes magnétiques fonctionnalisées avec de la streptavidine ; les candidats non fixés sont éliminés par lavage et l’élution des candidats positifs se fait à haute température. Les produits de PCR et de transcription sont purifiés par filtration sur le module Te-VacS™ qui comprend deux positions distinctes d’aspiration pour récupérer (ou non) la phase éluée. Outre le gain de temps, le SELEX automatisé améliore la fiabilité et la reproductibilité du processus, fournissant ainsi des données de grande qualité pour des études approfondies.

Nous utilisons actuellement des méthodes SELEX automatisées pour identifier des ligands à forte affinité, dirigés contre des ARN viraux et diverses protéines intéressantes sur le plan diagnostique. Nous nous concentrons plus particulièrement sur la recherche d’aptamères capable de se fixer à des régions de l’ARN viral impliqué dans l’expression des gènes et par conséquent participant au développement du virus [Toulmé et al. 2006]. Etre capable de maîtriser l’expression d’un gène viral sans affecter l’expression du gène de l’hôte constituerait une solution idéale pour empêcher le virus de se développer. Ces molécules peuvent être validées comme ayant un intérêt thérapeutique dans le cas des virus pathogènes tels que le VIH et le virus de l’hépatite C (VHC). Par exemple, la région 5’ non traduite des fonctions du VHC possède un site d’entrée interne du ribosome (IRES) qui est très préservé et qui est vital dans l’initiation de la traduction. Certaines parties de cette région, et plus particulièrement le domaine IIId, sont des cibles médicamenteuses potentielles, donc trouver des ligands qui fixent les régions sélectionnées avec une forte affinité représente un premier pas important dans la conception d’un médicament [Aldaz-Carroll 2002; Tallet-Lopez et al. 2003].

Références:
Aldaz-Carroll L, Tallet B, Dausse E, Yurchenko L, Toulme JJ. (2002) Apical loop-internal loop interactions: a new RNA-RNA recognition motif identified through in vitro selection against RNA hairpins of the hepatitis C virus mRNA. Biochemistry 41: 5883-5893.

Bellecave P, Andreola ML, Ventura M, Tarrago-Litvak L, Litvak S, Astier-Gin T. (2003) Selection of DNA aptamers that bind the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus and inhibit viral RNA synthesis in vitro. Oligonucleotides 13: 455-463

Chaloin L, Lehmann MJ, Sczakiel G, Restle T. (2002) Endogenous expression of a high-affinity psuedoknot RNA aptamer suppresses replication of HIV-1. Nucleic Acids Research 30: 4001-4008

Cox JC, Rudolph P, Ellington AD. (1998) Automated RNA selection. Biotechnology Progress 14: 845-850

Da Rocha Gomes S, Dausse E, Toulme JJ. (2004) Determinants of apical loop-internal loop RNA-RNA interactions involving the HCV IRES. Biochemical and Biophysical Research Communications 322: 820-826

Dausse E, Cazenave C, Rayner B and Toulmé JJ. (2005) In vitro selection procedures for identifying DNA and RNA aptamers targeted to nucleic acids and proteins. Methods in Molecular Biology 288: 391-410

Darfeuille F, Hansen JB, Orum H, Di Primo C, Toulmé JJ. (2004) LNA/DNA chimeric oligomers mimic RNA aptamers targeted to the TAR RNA element of HIV-1. Nucleic Acids Research 32: 3101-3117

Ducongé F and Toulmé JJ. (1999) In vitro selection identifies key determinants for loop-loop interactions: RNA aptamers selective for the TAR RNA element of HIV-1. RNA 5: 1605-1614

Tallet-Lopez B, Aldaz-Carroll L, Chabas S, Dausse E, Staedel C, Toulmé JJ. (2003) Antisense oligonucleotides targeted to the domain IIId of the hepatitis C virus IRES compete with 40s ribosomal subunit binding and prevent in vitro translation. Nucleic Acids Research 31 : 734-742

Toulmé JJ, Darfeuille F, Kolb G, Chabas S, Staedel C. (2003) Modulating viral gene expression by aptamers to RNA structures. Biology of the Cell 95 : 229-238

Toulmé JJ, Darfeuille F, Di Primo C and Dausse E. (2006) Aptamers to nucleic acid structures. ‘The aptamer handbook’, S Klussmann Ed., Wiley-VCH Verlag, pp 167-190

Ulrich H. (2005) DNA and RNA apatamers as modulators of protein function. Med Chem 1: 199-208

Zhang Z, Blank M, Schluesener HJ. (2004) Nucleic acid aptamers in human viral disease. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 52 : 307-315