Octobre 2006 - n°114
Caractérisation de carraghénanes par
SEC/GPC triple détection et détermination de la fraction de
produit de masse molaire inférieure à 50kDa (directive européenne
2004/45/EC)
Viscotek Europe, 69540 Irigny
Nicola Marheineke et Sandrine Olivier
Introduction
De nombreux hydrocolloïdes tels que les
agars, pectines, gélatines et carraghénanes sont utilisés
dans des applications alimentaires, pharmaceutiques et cosmétiques.
Ceux-là sont recherchés pour leur forte viscosité même
à faible concentration, et sont par exemple utilisés pour stabiliser
les produits en empêchant la sédimentation, la séparation
de phases, ou la cristallisation. L’optimisation des fonctions que ces
polysaccharides confèrent au produit fini va dépendre de la
connaissance de paramètres tels que les distributions en masse molaire
et en viscosité, et aussi de leur structure en solution. En particulier,
les carraghénanes sont extraits de certaines variétés
d’algues rouges. Différents types de carraghénanes (kappa,
iota, lambda, etc…) se distinguent par leur conformation et leur composition
chimique et sont utilisés comme épaississants, agents gélifiants,
stabilisants dans des produits tels que les desserts glacés, les produits
laitiers, ou encore le dentifrice.
Concernant la pureté des carraghénanes et des PES (Processed
Euchema Seaweeds), une directive européenne 2004/45/EC a été
adoptée récemment afin qu’un critère additionnel
soit mesuré sur ces produits. Il s’agit de déterminer
la fraction de produit de masse molaire inférieure à 50kDa.
Cette fraction doit être inférieure à 5%.
La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) est une technique
de caractérisation reconnue pour de tels polymères solubles
en phase aqueuse. En utilisant la SEC couplée à un détecteur
de diffusion de lumière à faible angle, un réfractomètre
et un viscosimètre différentiel 4 capillaires, les distributions
de masse molaire, de viscosité et de taille moléculaire, ainsi
que des informations sur l’architecture moléculaire, et les fractions
requises par la directive européenne ont été obtenues
en une seule analyse.
Cet article décrit donc l’utilisation de cette technique pour
la caractérisation de différentes types de carraghénanes
et la détermination de la fraction de produit de masse molaire en dessous
de 50kDa.
Instrumentation
TDA 302 de Viscotek constitué de 3 détecteurs
: diffusion de lumière à faible angle 7° ; réfractomètre
; viscosimètre différentiel 4 capillaires ; tous les détecteurs
sont en série.
GPCmax de Viscotek : dégazeur, pompe, passeur automatique équipé
d’une boucle de 100µl.
Logiciel : OmniSEC
Conditions analytiques
Eluent : 0,1M LiNO3
Débit : 0,6ml/min
Température : 70°C
Colonne : 2 colonnes ViscoGel pour GPC aqueuse.
Volume d’injection : 100µl
Analyse
Les 3 types de carraghénanes ont été
analysés sur un système de Triple Détection de Viscotek.
Alors que de nombreuses analyses de polysaccharides sont réalisées
à température ambiante, les carraghénanes démontrent
une solubilité limitée et doivent donc être analysés
à une température plus élevée. La solubilité
dépend aussi du type de carraghénane, la forme kappa étant
la plus difficile à solubiliser. La procédure de préparation
est critique afin de s’assurer que le produit est complètement
solubilisé avant l’analyse. Le maintien de la température
au cours de l’analyse est également un paramètre important
pour certains types de carraghénanes pour éviter la formation
de gels ou d’agrégats en cours d’analyse.
Résultats et discussion
Dans ces expériences réalisées
au sein du laboratoire d’applications de Viscotek, nous avons développé
une méthode pour déterminer de façon exacte et précise
les distributions en masse des carraghénanes. Un exemple de chromatogramme
des données brutes est représenté sur la Figure 1.
Les masses molaires sont obtenues directement pour tout types d’échantillons
à partir du détecteur de diffusion de lumière à
7° (LALS). Le LALS a l’avantage de mesurer la masse molaire directement
sans extrapolation ni calcul. A partir de cette mesure exacte de la distribution
en masse, il est possible de déterminer précisément le
pourcentage de produit de masse inférieure à 50kDa.
En outre, la viscosité a été mesurée à
partir du viscosimètre différentiel 4 capillaires.
La mesure de masse et de viscosité permet d’établir avec
précision le diagramme de Mark Houwink pour chacun des échantillons.
Les diagrammes de Mark Houwink des différents lots de carraghénanes
et de différents types (kappa, lambda, iota) ont été
comparés. La conformation aléatoire des carraghénanes
de type kappa a été confirmée par les diagrammes de Mark
Houwink (MH). Le diagramme de MH montre aussi que la relation structure/masse
n’est pas constante sur la distribution. Cela induit que toute méthode
par étalonnage conventionnel conduirait à des résultats
incorrects. Au contraire, la mesure par Triple Détection fournit une
masse molaire exacte pour tous les types d’échantillons grâce
à la mesure directe à faible angle (LALS) à 7°.
Les carraghénanes de type kappa et iota sont connus pour changer de
conformation avec la température. Il est supposé qu’au
dessus de 70°C, ils ont une conformation de type bobine alors qu’à
température ambiante, ils prennent une conformation de double hélice.
Cette information est facilement et directement observée sur le diagramme
de MH grâce aux mesures de viscosité. Les diagrammes de MH des
2 types kappa et iota montrent que leurs structures sont très similaires
sur l’ensemble de la distribution en masse molaire. A l’opposé,
le type lambda a non seulement une distribution en masse molaire différente
mais aussi un diagramme de MH qui confirme une structure bien distincte des
2 autre types (Figure 2).
Conclusion
Le système de Triple Détection
de Viscotek permet la caractérisation complète des carraghénanes.
Le détecteur de diffusion de lumière à faible angle permet
d’obtenir les distributions en masse molaire ainsi que la fraction de
produit de masse molaire inférieure à 50kDa de façon
exacte et précise, comme la directive européenne le requiert.
En outre, la mesure de viscosité permet d’étudier la conformation
des différents types de carraghénanes et grâce au diagramme
de Mark Houwink, de les comparer.
Toutes ces informations sont obtenues en une seule analyse par GPC/SEC. C’est
la combinaison des détecteurs qui rend la méthode si efficace.