Mars 2007 - n°119
Isolement et purification d’ADN à Température
ambiante
Vincent Hentzepeter, traduction Word’s Worth
WHATMAN France
L'ADN peut désormais être prélevé, isolé,
purifié et archivé à température ambiante grâce
à une nouvelle technologie brevetée. Le prélèvement
végétal peut être appliqué sur des cartes en papier
pré-enduites, soit directement, soit après une homogénéisation.
Les cartes sont ensuite envoyées au laboratoire par voie postale ordinaire.
L'institut NSure localisé à Wageningen - issu de la pépinière
d'entreprises de l'Université & Centre de recherche de Wageningen
et Keygen - affirme que ces cartes FTA offrent d'énormes atouts dans
la recherche moléculaire végétale à l'échelle
internationale.
La technologie FTA mise au point par Whatman assure la protection des acides
nucléiques d'un échantillon dès que celui-ci est déposé
sur une matrice de papier spécialement traité, intégrée
dans la carte. La formule FTA brevetée lyse les cellules et organismes
vivants tout en isolant et stabilisant les acides nucléiques dans la
matrice. La composition chimique conserve intact l'ADN à double brin
à température ambiante pendant plusieurs années. Le traitement
du papier n'est ni toxique ni dangereux ce qui permet de manipuler les cartes
en toute sécurité. Les pathogènes sont inactivés
et les acides nucléiques protégés contre toute influence
extérieure.
14 ans
Les cartes FTA sont compatibles à la fois avec les prélèvements
directs et avec les homogénats végétaux. Les prélèvements
homogénéisés doivent être pipettés au centre
de la carte. Une fois séchés, les échantillons peuvent
être purifiés immédiatement ou conservés à
l'abri de la lumière à température ambiante. Selon Whatman,
l'ADN fixé sur les cartes reste intact pendant des années. Une
purification d’ADN a même été réalisée
avec succès après 14 années de stockage. Whatman préconise
de sceller les échantillons dans des enveloppes multi-barrière
hermétiques en cas de stockage prolongé.
Conservation d'ARN
Les cartes FTA simplifient le prélèvement d'échantillons
provenant fréquemment de différentes origines dans le monde
entier.
Initialement mises au point pour l'isolement et le stockage d'ADN, les cartes
se sont avérées parfaitement adaptées pour le stockage
de l'ARN. La procédure de transfert de l'ARN est identique. Aucune
expertise particulière n'est nécessaire de sorte que, n'importe
où dans le monde, les clients peuvent collecter des échantillons
et transférer le matériel génétique sur les cartes.
Nsure a mis au point des kits de prélèvement sur mesure pour
plusieurs clients. Un kit de prélèvement de pins, par exemple,
comporte des cartes FTA, une petite fiole pour l'homogénéisation
de la solution et un broyeur miniature pour broyer les prélèvements.
«Ce produit est proposé sous forme d'un petit kit pratique»,
indique Peter Balk, directeur du développement produit de NSure. «Pour
chaque lot, le client prélève une quinzaine d'aiguilles de pins
de différents arbres, les coupe finement, les introduit dans le tube
à essai où elles sont pulvérisées, puis transfère
un peu de l'extrait obtenu sur une carte FTA à l'aide d'une pipette.
Les planteurs de poires en revanche possèdent habituellement un extracteur
de jus si bien que nous nous contentons de leur envoyer un compte-gouttes
pour le transfert des échantillons sur la carte. Une fois l'opération
réalisée, il suffit de laisser sécher complètement
puis d'envoyer le tout par la poste.» Si cela semble simple, c'est
parce que ça l'est. «En fait, les recherches d'ARN étaient
autrefois terriblement compliquées,» ajoute Balk. «Le
stockage nécessitait de l’azote liquide ou bien il fallait envoyer
les prélèvements végétaux à un laboratoire
en risquant des effets secondaires biologiques indésirables. Aujourd'hui,
grâce à ces cartes, rien de plus simple. Il vous suffit de les
emporter sur le terrain et vous revenez avec un échantillon représentatif.»
Test de tolérance au gel
Les cartes FTA sont devenues des équipements standards dans les tests
de qualité agricoles réalisés par NSure, une entreprise
de trois personnes récemment créée dans la ville hollandaise
de Wageningen. Jusqu'à présent, NSure testait la tolérance
au gel des sapins et épicéas ainsi que la maturité des
poires. Normalement, ces propriétés végétales
sont évaluées en exposant les prélèvements d'arbres
à des températures basses, en pressant le produit ou simplement
en mesurant le taux de sucre ou le pH. L'approche plus sophistiquée
de NSure fait appel à un test génétique. Le cofondateur
de la société, Peter Balk, en explique les avantages: «Notre
utilisation du diagnostic ARN est novatrice. Evaluer les dommages provoqués
par le gel sur les cellules prend au moins une semaine. Nous sommes capables
de réaliser l'opération en un jour seulement. Nous mettons à
profit le savoir-faire recueilli à l'Université et au Centre
de recherche de Wageningen. Nous recherchons des gènes indicateurs
et leur mode d'expression. Ces gènes ont été identifiés
par des expériences complexes de microarray (puce) d'ADNc.»
RT-PCR
A leur arrivée au laboratoire NSure, les cartes FTA sont poinçonnées,
puis l'ARN est isolé selon le protocole Whatman (voir encadré).
L'équipement nécessaire pour isoler l'ARN est sommaire même
si un thermocycler de PCR en temps réel est nécessaire pour
analyser une partie de l'ARN par transcription inverse. «La PCR
en temps réel (RT-PCR) nous permet d'observer directement comment un
gène a été exprimé par rapport à un autre,
les résultats sont immédiats » explique Balk.
Expertise et savoir-faire
Tout comme les cartes FTA, les équipements annexes de rinçage
et d'analyse ont été spécifiquement mis au point pour
l’isolement et le stockage de l'ADN. Pour traiter un grand nombre d'échantillons,
une automatisation du process peut s'avérer profitable. Les stations
de travail robotisées sont en mesure de traiter jusqu'à 96 échantillons
par heure. Différentes marques de robots sont compatibles avec les
cartes FTA. Cependant, aucune méthode automatisée n'a été
présentée pour l’élution et l'analyse d'ARN. «L'extrait
d'ARN présente une contamination telle que les réactions enzymatiques
restent bloquées si l'on utilise trop d'isolat. Ce point mérite
la plus grande attention. Il s'agit probablement d'un inconvénient
mineur de la méthode. Mais il faut garder en tête que sans ces
cartes, ce type de recherche ne pourrait même pas être réalisé.
Les opérations de prélèvement et de stockage fonctionnent
sans problème aussi longtemps que les cartes sont conservées
à l'abri de l'humidité. Après l'analyse, nous stockons
les quantités résiduelles tout simplement à température
ambiante chez NSure.»
Applications
NSure fait appel à la technologie FTA pour ses recherches moléculaires
sur les végétaux et en agriculture. Selon Whatman, cette technologie
peut également être appliquée dans les domaines tels que
les investigations médico-légales et alimentaires, le développement
de médicaments, le diagnostic, la génomique pharmaceutique et
l'identification vétérinaire.
Protocole Whatman
1. Couper finement la feuille
2. Mini-broyeur utilisé pour homogénéiser (partiellement)
les tissus
3. Aspiration de l'homogénat avec le compte-gouttes
4. Dépose d’ une goutte d'échantillon à l'aide
de la pipette
5. La carte FTA absorbe la gouttelette
6. Laisser sécher une heure, puis conserver la carte FTA dans une enveloppe
hermétique multi-barrière
7. Envoyer le sac d'échantillon par la poste à NSure, accompagné
du formulaire de commande identifié par un code exclusif.