Septembre 2007 - n°124

Des conditions proches de l’in vivo : observation de longue durée de cellules in vitro

Par Bionas

Grâce à son système de perfusion inédit, le Bionas® 2500 analyzing system permet pour la première fois l’observation de longue durée de cellules vivantes en présence de candidats médicaments et donc, également, l’analyse des effets de régénération. Le système de perfusion évite la concentration des produits du métabolisme dans la chambre de réaction.

Le Bionas® 2500 analyzing system permet l’observation en continu de cellules vivantes pendant une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs jours, en vue de l’analyse pharmacodynamique et cytotoxique de candidats médicaments. Cette technologie repose sur la culture de cellules vivantes sur des puces en silicium contenant des capteurs pour les paramètres pertinents au plan métabolique, comme la consommation d’oxygène des cellules tests, le taux d’acidification extracellulaire et l’adhésion cellulaire. Les puces sont fabriquées par la société Micronas GmbH selon un processus standardisé garantissant des produits de qualité reproductible.

Cette technique est facile à utiliser et permet une observation continue, non invasive et sans marqueur du métabolisme cellulaire en fonction des substances testées. Cette technologie peut être mise en œuvre avec de nombreux types et lignées cellulaires, y compris les cultures cellulaires primaires. Il est également possible d’analyser les rapports vis-à-vis des concentrations ou les effets de régénération.

Bionas® 2500 analyzing system

Pour analyser le métabolisme cellulaire, on dispose les puces à capteurs ensemencés avec des cellules dans le Bionas® 2500 analyzing system. Le système peut analyser parallèlement six puces à capteurs. Il est équipé d’une unité de microfluidique automatique qui alimente à intervalles réguliers programmables les cellules en millieu frais ou en millieu contenant la substance test. Le système de perfusion évite la concentration des produits du métabolisme dans la chambre de réaction.
La chambre de mesure proprement dite a un volume de 6 µl et permet donc une détection dynamique et très sensible des modifications extracellulaires. La mesure se fait de façon intermittente. L’appareil est équipé d’un logiciel de gestion et d’évaluation permettant de piloter directement le système et l’auto-échantillonneur et de visualiser les données en temps réel. L’auto-échantillonneur assure un traitement automatisé et sans surveillance de l’ensemble de la séquence de mesure.

Validation des cibles

Le Bionas® 2500 analyzing system est déjà utilisé par Solvay Pharmaceuticals, qui y voit une méthode précieuse pour les études de validation des cibles. Les chercheurs de Solvay sont particulièrement sensibles au fait que les cibles peuvent être analysées dans leur contexte physiologique.

Grâce à cette technologie, il est également possible de pratiquer un criblage phénotypique de substances dont on ne connaît pas encore les cibles. L’analyse des effets des substances sur la physiologie des cellules fournit des connaissances précieuses permettant d’identifier de nouveaux principes actifs contre le cancer, les maladies du métabolisme ou celles du système immunitaire. Ainsi, les cellules cancéreuses, par exemple, peuvent présenter des modifications du comportement en ce qui concerne la glycolyse et l’adhésion. Avec le système Bionas, il est donc possible de mener une recherche ciblée des substances accentuant ou inhibant ce comportement anormal. On peut imaginer la même procédure pour des substances modulant l’oxydation des acides gras (adiposité) ou la glycolyse et la respiration cellulaire (diabète).

Analyse de l’activité des GPCR

Le système Bionas peut également servir à l’analyse des récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). Dans ce cas, les capteurs IDES de la puce mesurent les variations de l’impédance dues à la stimulation des récepteurs. Les modifications de l’adhérence, de la morphologie et du volume cellulaires se traduisent par des variations de l’impédance extracellulaire et transcellulaire mesurée. Chacune de ces modifications physiologiques peut être causée par une stimulation des récepteurs et être mesurée par notre appareil.
Les modifications morphologiques des cellules induites par apoptose (atrophie, cytolyse, etc.) peuvent elles aussi être saisies avec une haute résolution temporelle par le système Bionas.

Analyse de l’hépatotoxicité

Le système Bionas® 2500 permet en outre des analyses de l’hépatotoxicité de candidats médicaments sur des types cellulaires comme les HepG2 et les hépatocytes primaires humains. La comparaison des hépatocytes primaires humains et des hépatocytes primaires de rat met en évidence l’avantage de l’observation en temps réel du métabolisme cellulaire. Les deux lignées de cellules primaires ont été cultivées dans un milieu spécial sur des puces à capteurs recouvertes de collagène. On a utilisé comme substance test du paracétamol (acétaminophène (AAP) : IC50 19 mM), dont on connaît la toxicité pour le foie. On a ajouté du paracétamol au bout de 3 à 4 heures.
Alors que sur les hépatocytes humains, seule l’activité respiratoire est réduite, les hépatocytes de rat présentent des effets nettement plus marqués. Le taux respiratoire se réduit plus rapidement et plus fortement. Pour les hépatocytes de rat, le taux d’acidification est nettement inhibé dès les 30 premières minutes d’exposition au paracétamol. En outre, l’adhésion des cellules à la surface de la puce baisse lentement mais de façon continuelle.

Pour analyser la régénérétion, on a ensuite irrigué les cellules avec du millieu seul (à partir d’environ 27 h, zone grise) au lieu de millieu additionné de paracétamol. Alors que les hépatocytes humains présentent une régénération complète, le taux d’acidification des cellules de rat n’atteint que 85 % et le taux d’oxygène que 70 % de l’activité initiale. L’adhésion ne présente aucune régénération, ce qui indique une détérioration durable des cellules.

L’observation continuelle des cellules met en évidence l’influence séquentielle du paracétamol sur le métabolisme cellulaire, influence qui n’aurait pas été détectée par une méthode point final. Tandis que les cellules humaines ont pu être utilisées pour d’autres tests, le paracétamol a causé des dommages irréparables aux hépatocytes de rat.

Optimisation des leads

Le Bionas® 2500 analyzing system peut également être utilisé pour optimiser les structures lead identifiées lors d’un criblage. En effet, l’optimisation successive de ces « leads » par la chimie médicale exige un contrôle permanent des cellules test, afin de détecter le plus tôt possible une toxicité éventuelle.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr. Dieter Runge (PRIMACYT GmbH), pour les cellules primaires et leur culture sur les puces à capteurs, ainsi que le Dr. Sabine Duntze (b3c communications), pour son soutien pour la communication spécialisée.