Septembre 2007 - n°124
Amélioration des analyses par LC/MS de composés
basiques à l’aide d’une phase mobile de pH élevé
sur une colonne Gemini® C18
Par Phenomenex
Introduction
Il est très intéressant de réaliser des séparations
par HPLC en phase inverse à pH élevé, bien au-dessus
des pKa de composés basiques. Lorsque le pH de la phase mobile est
supérieur de deux unités de pH aux pKa d’analytes basiques,
les espèces non chargées sont mieux retenues sur les phases
stationnaires de phase inverse. Résultats : temps de rétention
accrus pour les analytes basiques polaires sans avoir à utiliser d’agents
de pair d’ions, rétention plus reproductible,
formes de pic affinées, sélectivité de colonne alternative,
et élution dans une phase mobile dont la teneur organique est plus
élevée, ce qui est avantageux pour la détection LC/MS.
« Contrairement aux attentes, les phases mobiles à pH élevé
NE SUPPRIMENT PAS l’ionisation des composés basiques dans l’ESI+;
des ions positifs sont formés en abondance… »
L’un des éventuels inconvénients du fait de travailler
à un pH basique pourrait être une diminution importante de la
sensibilité de la détection par spectrométrie de masse,
dans des conditions supprimant l’ionisation des analytes en solution.
Étant donné que l’état d’ionisation des molécules
d’analytes dépend du pH de la phase mobile, il est attendu que
l’efficacité d’ionisation de la LC/MS avec electrospray
(ESI) en mode cationique (PIM) soit réduite de manière significative
dans les phases mobiles à pH élevé. On emploie de façon
courante des acides faibles volatils pour améliorer l'ionisation des
composés basiques en ESI+. Ainsi, l’analyse LC/MS des composés
médicamenteux basiques en phases mobiles à pH élevé
(>pKa+2) pourrait être compromise, si les rendements d’ionisation
en phase gazeuse en ESI+ étaient étroitement liés à
l’équilibre acide-base de la solution. Néanmoins, plusieurs
analystes ont réussi à obtenir la détection de composés
basiques particuliers en ESI+, avec l’utilisation de tampons de pH élevé
dans la phase mobile.
Dans nos travaux précédents, nous avions indiqué avoir
réussi la détection de plusieurs classes importantes de médicaments
basiques, notamment des antihistaminiques, des béta-bloquants, des
opiacés, et des antidépresseurs tricycliques dans des conditions
de phase mobile qui empêchent leur ionisation en solution. Nous avons
comparé les réponses pour l’ESI+ de plusieurs groupes
de médicaments basiques dans une vaste plage de polarités (log
P 0,09 ~7,6) et de pKa (8 ~10), dans des phases mobiles à pH acide
et basique. Les intensités du signal des analytes observées
dans l’acide formique à 0,1 % avec acétonitrile ont été
comparées aux intensités observées dans des tampons d’hydrogénocarbonate
d’ammonium 10 mM, à différents pH (7,8 à 11) dans
l’acétonitrile. Contrairement aux attentes, les phases mobiles
à pH basique NE suppriment PAS l’ionisation de composés
basiques dans l’ESI+ ; des ions positifs sont formés en abondance,
et les réponses des analytes sont souvent meilleures avec un pH basique
que dans des phases mobiles acides. Les résultats montrent que l’utilisation
de phases mobiles à pH élevé pour l’analyse de
composés basiques représente une alternative satisfaisante à
la pratique actuelle, qui consiste à utiliser des phases mobiles de
pH acide en LC/MS avec ESI+. Ce qui est tout à fait significatif, car
on étend ainsi les applications de méthodes génériques
d’élution à l’analyse de composés basiques
polaires, auparavant difficiles à retenir par chromatographie en phase
inverse sans compromettre la détection par spectrométrie de
masse.
Nous avons testé l'utilisation de phases mobiles à pH élevé,
pour la quantification de composés basiques par LC/MS/MS avec ESI+,
en comparant les seuils de détection (LOD), les seuils de quantification
(LOQ), les plages de linéarité, la précision et l’exactitude
obtenues avec des phases mobiles de pH basique et acide.
Résultats et analyses
Procédé LC/MS et sondes d’essai
Nous avons présenté les intensités du signal pour une
grande variété de médicaments basiques en mode SIM avec
electrospray, en fonction du pH de la phase mobile. De façon générale,
l’optimisation de la source d’ions et le réglage du spectromètre
de masse se font dans une phase mobile acidifiée, riche en modificateur
organique, qui améliore la formation abondante d’ions positifs
(bases protonées). Nous avons donc optimisé tous les réglages
du détecteur en conditions acides dans une solution d’acétonitrile
et d’acide formique à 0,1 %, 1:1. Afin d’étudier
l’effet du pH de la phase mobile sur la réponse par MS des composés
basiques, nous avons inclus dans cette étude une diversité de
bases polaires et non polaires, couvrant une large plage de pKa. Les mélanges
standards ont été préparés à une concentration
de 200 ng/ml, dans un solvant faible, afin d’éviter les déformations
de pics pour les composés basiques polaires éluant rapidement.
Les analyses ont été effectuées sur une colonne Gemini
C18 de petit diamètre.
Influence des phases mobiles et de la sélection
du tampon de pH.
L’élution en phase inverse des composés basiques, lorsqu’ils
ne sont pas chargés, entraîne des temps de rétention significativement
plus longs des formes de pic plus fines et souvent une modification de l’ordre
d’élution (indiquant une sélectivité de colonne
alternative). De tels changements constituent une amélioration significative
du pouvoir de résolution de la colonne. Le tampon bicarbonate d’ammonium
/ ammoniaque (NH4HCO3 / NH4OH) s’étend sur une large gamme de
pH de 7,8 à 11, avec un pouvoir tampon élevé. Son caractère
thermolabile le rend compatible avec les détecteurs MS. Bien que ce
tampon supprime l’ionisation des médicaments basiques en solution
à un pH élevé, on observe que les intensités de
signal des espèces basiques en ESI+ sont supérieures dans les
tampons bicarbonate d’ammonium, que dans l’acide formique à
0,1 %.
Seuil de quantification et linéarité
des réponses
Le seuil de quantification (LOQ) est considéré comme étant
la quantité minimale d’analyte sur la colonne qui fournit un
S/B de 10. La plupart des composés basiques étudiés ont
été quantifiés avec succès à la concentration
de 1,25 pg, ou mieux, certains à des concentrations aussi faibles que
50 fg. Une comparaison des rapports S/B à des concentrations très
faibles (50 pg/ml) révèle que la plupart de ces composés
basiques peuvent être détectés avec une meilleure sensibilité
dans des phases mobiles à pH basiques (figure 5) que dans des conditions
acides. Seuls la carbamazépine (LOQ>1 250 fg) et l’amiloride
(LOQ>750 fg) ont été détectés avec un S/B inférieur
dans une phase mobile à pH élevé. La linéarité
des réponses a été étudiée dans la plage
de concentrations de 0,05 à 100 ng/ml pour tous les composés
basiques. Les résultats (dont certains sont indiqués sur la
figure 6) démontrent une bonne linéarité avec des valeurs
R2 supérieures à 0,997.
Précision et exactitude
La précision du procédé a été déterminée
par des analyses répétées (n=6) pour quatre concentrations
: 0,05 ng/ml, 0,25 ng/ml, 1,00 ng/ml et 100 ng/ml. Le tableau 2 indique un
ETR < 15 % pour la concentration 0,05 ng/ml et <12 % pour la concentration
100 ng/ml. L’exactitude du procédé a été
évaluée par comparaison de la valeur moyenne des six analyses
répétées avec la valeur de concentration attendue pour
les différentes concentrations. Les concentrations analysées
ont été déterminées par régression linéaire
des résultats obtenus, sur des calibrateurs standards. L’exactitude
dépassait 80 % pour la plupart des analytes lorsqu’ils ont été
quantifiés pour leur concentration LOQ respective et égale à
100 % pour la concentration 100 ng/ml.
Conclusions
• L’utilisation de phases mobiles basiques pour l’analyse
en LC/MS/MS avec ESI+ des médicaments basiques a été
évaluée, sur une large plage de polarités et de pKa,
en comparant les seuils de détection et de quantification, les plages
de linéarité et le degré d’exactitude observé
dans les phases mobiles acides et basique.
• La réussite de la quantification des composées basiques
par LC/MS/MS avec ESI+ dans une phase mobile contenant un tampon de pH élevé
a été démontrée.
La plupart des composés basiques étudiés peuvent être
détectés avec une meilleure sensibilité dans de la phase
mobile de pH basique que dans la phase mobile de pH acide.
• Les résultats démontrent la possibilité d’effectuer
l’analyse des composés basiques dans des phases mobiles à
pH élevé par LC/MS/MS avec ESI+ avec une meilleure sensibilité,
de bonnes linéarité, précision et exactitude, à
l’aide de la colonne Gemini® 5 µm C18.
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