Septembre 2007 - n°124

Elimination 3x plus rapide des protéines dans les échantillons HPLC !

Par WHATMAN

Les unités de filtration Mini-UniPrep™ (MUP) de Whatman représentent une alternative très efficace et aisément manipulable pour éliminer les protéines indésirables dans les échantillons destinés aux analyses HPLC/MS. Cette méthode, basée sur la précipitation à l’acétonitrile et la filtration sous pression des protéines dans le plasma, le sérum, le sang complet ou les autres fluides biologiques, est tout particulièrement adaptée à la caractérisation de substances d’intérêt lors de la recherche de nouveaux principes actifs.

L’architecture unique des unités de filtration permet la préparation des échantillons dans un seul tube. L’unité de filtration MUP se compose d’une chambre destinée à l’échantillon, d’un filtre intégré séparant la chambre de l’échantillon du réservoir de collecte du filtrat et d’un septum permettant la ponction du filtrat avec une seringue directement dans le réservoir afin de procéder aux analyses. La manipulation des unités de filtration MUP est un jeu d’enfant et leurs dimensions sont compatibles avec les autosampleurs courants. Pour résumer, ces unités permettent non seulement d’économiser du temps et de l’argent, mais réduisent également le risque d’une contamination secondaire des échantillons à analyser due aux étapes de transfert associées à la méthode de centrifugation habituelle.

Élimination efficace des protéines dans différents types d’échantillons

L’efficacité de l’élimination des protéines avec Mini-UniPrep a été déterminée pour différents types d’échantillons. Pour cela, des échantillons de plasma, de sérum et de sang total (50% (v/v) dilué dans de l’eau [H2O] ont été purifiés selon le protocole de précipitation protéique par Mini-UniPrep (MUP-PPT) et la méthode « spin » conventionnelle, pour une comparaison directe (mêmes échantillons). Conformément à cette méthode, les échantillons ont été introduits dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml au lieu d’une unité MUP, les protéines précipitées ont été centrifugées pendant 5 min. à 10’000 x g et le surnageant obtenu a été recueilli dans un tube propre pour l’analyse. La quantification protéique a été réalisée avec un test micro-BCA. Le diagramme de résultats 1 montre le pourcentage de diminution de la concentration en protéines dans chaque échantillon. Avec les deux méthodes, la diminution de la concentration protéique a été presque identique dans tous les échantillons. Plus de 96 pour cent des protéines ont été éliminées des échantillons.

Reproductibilité de l’élimination des protéines

La reproductibilité de l’élimination des protéines a été déterminée avec des échantillons de plasma. Pour cela, un échantillon de sérum prélevé sur un patient sain a été purifié 40 fois selon le procédé MUP-PPT. Le filtrat a été à chaque fois recueilli, séché dans un tube de microcentrifugation et resuspendu dans du tampon pour analyse de la teneur en protéines avec la méthode micro-BCA. Le pourcentage de diminution de la teneur en protéines a été ensuite calculé sur la base de la différence entre la concentration protéique avant et après la filtration du mélange plasma/acétonitrile. Le diagramme 2 montre l’excellente reproductibilité des résultats, avec une diminution de la concentration en protéines dans l’échantillon plasmatique de plus de 99 %.

Protocole de précipitation protéique Mini-UniPrep

L’élimination des protéines avec les unités MUP est simple et ne comprend que quelques étapes. Le diagramme 3 montre une représentation schématique de la procédure. Contrairement à la méthode « spin » traditionnelle, les étapes de centrifugation et de transfert du surnageant dans un nouveau tube sont absentes avec les MUP. Le transfert est associé à un risque de contamination secondaire de l’échantillon ou d’introduction de protéines dans le nouveau tube. Ce risque peut être contourné grâce à l’utilisation des MUP car la séparation des protéines est assurée par le filtre intégré dans l’unité.